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第三节 细菌的遗传分析
作者:农学院    文章来源:浙江大学精品课程网    点击数:2006    更新时间:2007/7/5
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  一、转化(transformation):

  概念:某些细菌通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段,将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程。

  1928年,格里费斯(Griffith F.)在肺炎双球菌中发现转化现象。
  1944年,阿委瑞(Avery O. T.) 进行肺炎双球菌转化试验;
  证实遗传物质是DNA;
  转化是细菌交换基因的方法之一。

  转化的条件:细菌活跃摄取外源DNA分子;具备重组程序所必需的酶。
  转化三种细菌:肺炎双球菌;枯草杆菌;流感嗜血杆菌。
  转化的两个例子:
  ①.用两个带有不同抗性的肺炎双球菌群体混合可以发现带有双抗性的细菌。

  细菌裂解DNA残留其它细菌摄取转化。
  ②.枯草杆菌活细胞表面分泌DNA,可被其它细胞摄取。
  ㈠、供体与受体的互作:
  ①.转化片断的大小:
  肺炎双球菌转化:DNA片断至少有800个碱基对;
  枯草杆菌的转化:DNA片断至少有16000个碱基对。
  ②.供体DNA分子存在的数目:
  供体DNA分子数目与特定基因的成功转化有关。
  链霉素抗性基因转化:每个细胞含有10个DNA分子之前,抗性转化体数目一直与DNA分子存在数目成正比。
  原因:细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的DNA接受座位,故一般细菌摄取的DNA分子数<10个。
  ③.受体的生理状态:
  感受态是处于刚停止DNA合成、而蛋白质合成继续活跃进行时的状态。
  活跃合成的蛋白质可使细菌细胞壁易于接受转化DNA。
  只有感受态受体细胞才能摄取并转化外源DNA,而这种感受态也只能发生在细菌生长周期的某一时间范围内。

  ㈡、转化DNA的摄取和整合过程:
  ①.结合与穿入:
  DNA分子结合在接受座位上(可逆),可被DNA酶降解;接受座位饱和性。
  DNA摄取(不可逆),不受DNA酶破坏。
  穿入后,由外切酶或DNA移位酶降解其中一条链。
  ②.联会:
  按各个位点与其相应的受体DNA片段联会。亲缘关系越远,联会越小、转化的可能性越小。
  ③.整合(重组):
  是指单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换稳定地进入到受体DNA。
  对同源DNA具有特异性。
  异源DNA,视亲缘关系远近也可发生不同频率整合。

转化DNA
转化DNA

  黎德伯格等用枯草杆菌进行转化和重组试验:
  DNA 片段进入受体细胞后,可与受体染色体发生重组。紧密连锁的两个基因有较多的机会在同一个DNA片段中同时整合到受体染色体中。

重组试验

  三者并发转化的频率高,故这3个基因是连锁的,其中his2和tyr1连锁最为紧密:


  单交换时,染色体开环易降解,故不存在单交换类型;只有双交换和偶数的多交换才有效。
  二、接合(conjugation):

  1. 概念:是指原核生物的遗传物质从供体(donor)转移到
    受体(receptor)内的过程。
  特点:需通过细胞的直接接触。
  右图为原核生物的转移。

原核生物


  2.实例:黎德伯格和塔特姆(1946年):
  不同营养缺陷型的大肠杆菌:
  A菌株:Met- bio- thr+ leu+,需加甲硫氨酸和生物素。
  B菌株:Met+ bio+ thr- leu-,需加苏氨酸和亮氨酸。
  A菌株和B菌株营养缺陷型,不能在基本培养上生长。
  A+B菌株混合培养,在完全培养基上,几小时后离心,涂布基本培养基上,长出原养型(Met+ bio+ thr+ leu+)菌落。
  左下图为A菌株、B菌株实验。
  这种原养型细胞如何出现?
  培养基上一边加压和吸引使培养液充分混合结果任何一臂的培养基上均未长出原养型细菌。
  ∴直接接触(接合)是原养型细胞出现的必要条件。
  海斯(Hayes W.,1952)证明:
  接合过程是一种单向转移,A菌株遗传物质B菌株,从供体(donor)到受体(receptor)。

A菌株、B菌株实验
U型管实验

  ㈠、F因子及F+向F-的转移:

  ⑴.F 因子:致育因子(性因子),是一种附加体。
  携带F因子的菌株称为供体菌或雄性,用F+表示。
  未携带F因子的菌株为受体菌或雌性,用F-表示。
  ⑵.F因子的组成:
  染色体外遗传物质,环状DNA;
  40-60个蛋白质基因;
  2-4个/细胞(雄性内)。

F因子的组成

  ⑶.F因子的三种状态:
  以大肠杆菌为例:
  ①.没有F因子,即F-;
  ②.一个自主状态F因子,即F+;
  ③.一个整合到自己染色体内的F因子,即Hfr。
F因子的三种状态
  ⑷.自主状态时F因子独立进行分裂。
F因子独立进行分裂

  ㈡、Hfr细胞的形成及染色体的转移:
Hfr细胞

  部分二倍体:
  当F+或Hfr的细菌染色体进入F-后,在一个短时期内,F-细胞内的某些位点就会成为二倍体DNA。

  部分二倍体中发生交换:
  单数交换:打开环状染色体,产生一个线性染色体,这种细胞是不能成活的。
  偶数交换:产生可遗传的重组体和片段。

  ㈢、中断杂交试验及染色体连锁图:
  50年代,雅科(Jacob F.)和沃尔曼(Wollman E.):
  中断杂交试验:发现接合时遗传物质转移是直线进行。

  其方法为:
  ⑴.Hfr菌株与F-菌株混合培养。
  Hfr菌株:strs a+ b+ c+ d+  对链霉素敏感
  F-菌株: strr a- b- c- d-   抗链霉素
  ⑵.不同时间取样搅拌器中断杂交稀释含链霉素完全培养基杀死Hfr细菌抗str细菌菌落影印培养法:鉴定a+b+c+d+各基因转移时间。
  ⑶.实例:
  Hfr菌株:苏氨酸(thr+)、亮氨酸(leu+)、抗叠氮化物(azir)、抗T1噬菌体(tonr)、半乳糖(gal b+)、乳糖(lac+)。
  F-菌株:thr-、leu-、azis、tons、galb-、lac-型。
  ①.8分钟时:thr+进入F-细胞;
  8.5分钟时:leu+进入F-细胞;
  ②.9分钟时:出现叠氮化物抗性的菌落,少数azir基因进入F-细胞;
  ③.11分钟时:出现抗噬菌体T1的F-细菌;
  ④.18和25分钟时:分别出现乳糖和半乳糖发酵基因,即lac+和gal b+进入F-细胞。

中断杂交试验
  ①.重组体中各标志基因进入F- 细胞中时间不同,达到最高水平的时间也不同;
  ②.随时间的推迟,某个基因的重组率增加;一定程度后,重组率便不再增加。
  如:10’tonr首次出现, 15’时40%、25’后80%。
  Hfr中基因是按一定的线性顺序依次进入F-菌株的。
中断杂交试验

  请看表:大肠杆菌Hfr+ thr+leu+lac+gal+azistonsstrs×F-thr-leu-lac-gal-azir tonr strr的结果
  下图为以基因出现的时间为标准作出E. coli的遗传连锁图。


  ⑷.用一种大肠杆菌的不同Hfr菌株进行中断杂交实验,作出连锁图,其基因向F-细胞转移的顺序不同。
Hfr类型
原点
基 因 转 移 顺 序
HfrH
O
thr pro lac pur gal his gly thi
O
thr thi gly his gal pur lac pro
O
pro thr thi gly his gal pur lac
O
pur lac pro thr thi gly his gal
AB312
O
thi thr pro lac gur gal his gly

  转移的顺序是不是随机?例如:thr thi gly 。
  Hfr1和HfrAB312菌系的中断杂交试验及其连锁图(左下图):
中断杂交试验连锁图
原点和转移方向不同

  差异:不同Hfr菌株转移的原点(O)和转移方向不同。进一步说明了F因子和细菌染色体都是环状。见上右图。

  ㈣、重组作图:
  两基因转移时间间距<2分钟时,中断杂交法的图距不够精确,应采用传统的重组作图法。
  例:二个基因紧密连锁:
    lac-(乳糖不发酵)
    ade-(腺嘌呤缺陷型)

重组作图
重组作图

  基因间重组频率

  两个位点间的时间约为1分钟,约相当于20%的重组值。         

  三、性导(sexduction):

  性导:指接合时由F' 因子所携带的外源DNA整合到细菌染色体的过程。
  F因子整合过程:可逆,发生环出时,F因子又可重新离开染色体(下右图)。
  Adelberg和Burns(1959):
  * F因子偶尔在环出时不够准确,会携带出染色体上的一些基因,这种因子称为F'因子。
  * F'因子携带染色体的节段大小:从一个标准基因到半个细菌染色体(下中图)。
  F’因子使细菌带有某些突出的特点:
  ⑴.F'因子转移基因频率极高,如同F+因子转移频率;
  ⑵.F'因子自然整合率极高,并且整合在一定的座位上(下左图)。
   携带与细菌染色体一样的同源区段;而正常F因子可在不同座位整合。

F因子整合可逆

F因子环出
F'因子转移

  雅科和阿代尔伯格发现:特殊的Hfr菌株能把lac+ 等位基因高频率地转移到Flac-受体中。
  ①.lac基因位于远端,中断杂交实验中只有1/1000重组率;
   ②.由F'携带lac+ 基因进入受体后可在lac位点上形成部分二倍体F'lac+ / lac-。

lac转移

  性导在大肠杆菌遗传研究中的作用:
  ①.分离出大量F'因子(每个F'因子携带有不同大肠杆菌基因),利用不同基因在一起的并发性导的频率来作图;
  ②.通过性导产生部分二倍体,确定等位基因位置、显隐性关系提供了重要方法;
  ③. 性导形成的部分二倍体可用作互补测验确定两个突变类型是否属于同一个基因。
  并发性导(co-sexduction):
  是建立遗传图的另一手段,两个位点必须密切相连才能处在同一个F'因子上。
  获得两个位点间重组率每个片段的连锁群。
  性导作图法与转导作图法相同。
  四、转导(transduction):

  1.概念:是指以噬菌体为媒介进行细菌遗传物质重组的过程,是细菌遗传物质传递和交换方式之一。
  2.特点:
   以噬菌体为媒介细菌的一段染色体被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内通过感染转移到另一个受体细胞内。
   感染细菌的能力决定于噬菌体的蛋白质外壳。
  3.例如:
  黎德伯格与津德(1951)发现鼠伤寒沙门氏菌中转导现象。
  ⑴. 将两个沙门氏菌的营养缺陷型进行杂交:
  phe- trp- tyr- met+ his+ × phe+ trp+ tyr+ met- his-
                  混合培养
            在基本培养基发现原养型的菌落
               频率为1/105

  ⑵.产生上述结果的原因:
  ①.是否属于恢复突变?
    高频率出现不可能是回复突变。
  ②.是否属于接合、性导?
    戴维斯U型管试验(防止细胞直接接触)结果也获得野生型重组体,排除由于接合或性导而产生基因重组可能性。
  ③.是否属于转化?
    结果表现为不受DNA酶的影响,排除了由于DNA片断通过滤片经转化实现基因重组可能性。
  ⑶. 唯一可能的结论是:这种重组通过一种过滤性因子实现。这种过滤性因子称为FA,不受DNA酶的影响。FA为噬菌体P22(溶源性)。

  ㈠、普遍性转导:
  1.作用:可转导细菌染色体组的任何部分。

普遍性转导


  转导颗粒:把细菌染色体片段包装在噬菌体蛋白质外壳内而产生的假噬菌体,其中并不包含噬菌体的遗传物质。

  2.测定细菌基因间的连锁关系:
  以普遍性转导噬菌体P1为例,测定大肠杆菌的leu(亮氨酸合成)、thr(苏氨酸合成)、azi(叠氮化钠抗性)三个基因的顺序。


  每个选择的标记基因进行多次试验:
实验
选择的标记基因
未选择的标记基因频率
1
leu+
50%azir 2%thr+
2
thr+
3%leu+ 0%azir
3
leu+ thr+
0%azir

  3个位点之间的连锁关系:
  实验1: 2种可能排列:
      azi leu      thr
         leu azi    thr
  实验2:肯定3个基因的顺序是:
      azi leu      thr
  实验3:
     证明这一顺序,因为leu+和thr+片段之间从未携带有azir。
  通过合转导关系求出两基因之间的物理距离:

  由以上公式可知:
  转导DNA的平均长度约为1个病毒基因组的大小;通过试验测知两个基因的合转导频率,就可估算出两个基因间的物理距离。

  ㈡、特殊性转导:由温和噬菌体进行的转导。

特殊性转导

  特点:转导仅限于靠近原噬菌体附着点的基因。
  以λ噬菌体为例:λdgal颗粒形成过程:
λ噬菌体

  噬菌体的侵入,导致重组性转导。
噬菌体的侵入

  应用中断杂交技术、重组作图、转化和转导相结合细菌非常详细的染色体连锁图谱。
  1963年,E.coli已定位近100个基因(下图);
  1990年,定位基因已超过1400个;
  1997年完成全部测序:4639221对碱基,其功能基因已基本了解。
染色体连锁图谱

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