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第一节 基因工程
作者:农学院    文章来源:浙江大学精品课程网    点击数:5581    更新时间:2007/7/5
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一、基因工程概述:

  广义遗传工程包括:生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。
  狭义遗传工程是指:基因工程(重组DNA技术)。

  1.概念:
  基因工程:在分子水平上,采取工程建设方式按照预先设计的蓝图借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去使后者定向获得新遗传性状的一门技术。
  基因工程技术的建立,使实验生物学领域产生巨大变革。

  2. 发展:
  1971年,史密斯(Smith H. O.)等人从细菌中分离出的一种限制性酶酶切病毒DNA分子,标志着DNA重组时代的开始。
  1972年 伯格(Berg P.)等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA,将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子。
  1973年,科恩(Cohen S.)等进一步将酶切DNA分子与质DNA连接起来,并将重组质粒转入E.cloi细胞中。
  1982年,美国食品卫生和医药管理局批准,用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。
  1985年,转基因植物获得成功。
  1994年,延熟保鲜的转基因番茄商品生产。
  1996年,克隆羊诞生。

质粒

克隆羊

转基因植物种植面积

  1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷,1997年为1100万公顷,1998年2780万公顷,1999年3990万公顷,2000年4420万公顷,2001年5260万公顷,2002年5000万公顷。
  2001年种植面积>100万公顷的转基因作物:
  大豆(3330万hm2,占全世界转基因作物的63%,均为抗除草剂大豆)、玉米(980万hm2 ,占19% )、棉花(680
万hm2 ,占13% )、油菜(270万hm2 ,占5% );
  其它还有水稻、小麦、花生、日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯等,番茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已培育成功。
  主要分布在美国(3570万hm2)、阿根廷(1180万hm2)、加拿大(320万hm2)和中国(150万hm2)等国。
  下图为2001年全世界转基因作物占相应作物种植总面积的比较

转基因作物占相应作物种植总面积的比较

  2001年我国的转基因农作物和林木已达22种,其中转基因棉花、大豆、马铃薯、烟草、玉米、花生、菠菜、甜椒、小麦等进行了田间试验,转基因棉花已经大规模商品化生产。

  3.内容:
  ①.从细胞和组织中分离DNA;
  ②.限制性内切酶酶切DNA分子,制备DNA片段;
  ③.将酶切DNA分子与载体DNA连接构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子;
  ④.把重组DNA分子引入宿主受体细胞复制;
  ⑤.重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞建立无性繁殖系(clone)或发育成个体;
  ⑥.从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系并使外源基因在受体细胞中正常表达,翻译成蛋白质等基因产物、回收;或筛选出获得定向性状变异的个体。

  二、限制性内切核酸酶:

  1. 限制性内切酶(restriction enzyme):
   一种水解DNA的磷酸二脂酶,遗传工程中重要工具。
   细菌细胞中存在限制修饰系统:
   限制:降解外源DNA,防御异源遗传信息进入的手段。
   修饰:修饰外源DNA片段后,保留在新细胞中。
  * 限制性内切酶如:EcoR I、Hind III:
  酶切方式:以交错方式切断DNA双链,产生二个相同单链粘性末端。
  重组过程:两种片段在适宜条件下,可经磷酸二脂链,连接成重组DNA分子。

内切酶

  ⑴.限制性内切酶的命名:
  根据其来自的生物名称,用英文字母和数字表示;
  ①. EcoR I 来自大肠杆菌(Escherichia coli);
  ②. Hind Ⅲ来自嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。
  ⑵.限制性内切酶的类别:
  第Ⅰ类酶(切割部位无特异性):
  如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000),作用时需ATP、Mg++等辅助因子。
  第Ⅱ类酶(切割部位有特异性):
  如EcoR I(大肠杆菌)、Hind Ⅲ(嗜血杆菌),分子量较小(约 20000-100000),作用时需Mg++存在。
  第Ⅱ类酶特点:
  * 切割产生平齐末端(blunt ends),如Sma I:

内切酶

  * 有的产生粘性末端(sticky ends),如BamH I、 Pst I :
  * 识别特定碱基顺序,如回文对称序列(palindrome,又称反向重复序列,从两个方向阅读其序列相同的序列)。

内切酶

  下图为部分常用的限制性内切酶。

常用的限制性内切酶
  三、载体(vector):

  运载工具:将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。
  DNA片段+适合的载体DNA重组DNA在载体DNA的运载下,高效率地进入宿主细胞,并在其中进行复制。
  DNA载体:质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等。
  载体的条件:
  ①.具有复制原点,能自我复制;
  ②.具多克隆位点(multiple cloningsite,MCS 或polylinker region),即有多种限制酶的切点;
  ③.选择时的遗传标记,如抗生素基因;
  ④.易从宿主细胞中回收。

  ㈠、细菌质粒:
  质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。
  质粒具有重组表型检测标记,检测是否携带外源DNA片段。
  在细胞内的复制程度:
  严紧型:一个细菌细胞内质粒数量有1-2个;
  松驰型:每个细胞内有的20-60个。
  下面右图为pUC19质粒,左图为pUC18质粒。

pUC19质粒
pUC18质粒

  如pUC18质粒具有以下特点:
  ①. 分子量小,可接受较大外源片段;
  ②. 拷贝数多,500个/细胞;
  ③. 克隆位点的酶切位点多,克隆方便;
  ④. 具有用于检测重组质粒的选择标记(α–互补的显色表型)。

  ㈡、λ噬菌体(温和型):
  基因组全长为49kb。
  噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇,两端为DNA左、
右臂。
  中间基因簇可被外源DNA替代而不影响侵染细菌能力。
  能接受15kb外源DNA片段作为cDNA或核DNA克隆载体。
  优点:
  * 不易引起生物危害,有助于“目的”基因进入细胞并增殖;
  * 携带大片段外源DNA分子,占总量25%时仍不失活。
λ噬菌体

  ㈢、柯斯质粒(cosmid):
  噬菌体DNA部分细菌质粒DNA序列柯斯质粒。
  有噬菌体cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。
  这种质粒分子量较小,但可接受长达50kb的外源DNA片段克隆真核生物基因。
  ∵一个长片段DNA可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。
柯斯质粒

  ㈣、穿梭载体(shuttle vectors):
  指能在两种不同生物中复制的载体。
  如能在原核生物(如E.coli)、真核细胞(如酵母)中复制的载体。
  穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列(Auto-nomously replicating sequence,ARS)以及两者的选择标记。
  穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因,在酵母重用与基因表达分析。  
  酵母菌的YEp (yeast episomaplasmid)等系列载体均是穿梭载体。

穿梭载体

  ㈤、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC):
   BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子改造成BAC载体,甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段

  特点:
  带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的;
  载体分子量很小(7.4kb);
  选择标记:氯霉素抗性基因;
  多克隆位点。
细菌人工染色体

  ㈥、酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC):
  YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因;还具有酵母菌染色体一些特点;可接受100-1000kb的外源DNA片段。
  YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具;并促进了人类人工染色体(human artificial chromosome,HAC)的研究。
  1996年完成了酵母菌全基因组序列的测定(右图)。
  pYAC4特点:
  1.两个可在酵母菌中利用的选择基因,URA3和TRP1(色氨酸合成基因);
  2.酵母菌着丝粒序列(CEN4);
  3.一个自主复制序列(ARS1);
  4.两个嗜热四膜虫末端重复序列(TEL)保持重组YAC为线状结构;
  5.在两个末端序列中间,有一段填充序列(His3),使pYAC4在细菌细胞中能稳定扩增;
  6.Amp抗性及细菌质粒复制原点;
  7.一个EcoR I 克隆位点,位于酵母菌Sup4tRNA基因内。
  右图为酵母菌人工染色体pYAC4:
  在克隆外源DNA时,用BamHI和EcoRI双酶切,得到二个人工
染色体臂,与EcoRI酶切的外源DNA片段连接,构成重组的酵母人工染色体,用于转化酵母菌。

人工染色体pYAC4
  ㈦、Ti质粒及其衍生载体:
  适合于植物的载体系统将重组DNA运载到植物细胞中目的基因表达。
  Ti质粒(细菌质粒):
  自然存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,革兰氏阴菌)细胞可诱导植物产生瘤细胞(tumor-inducing, Ti)冠瘿瘤(grown galltumors)。

  Ti质粒有一部分转移DNA(transfer DNA,T-DNA)当农杆菌感染植物时,T-DNA便转移到植物染色体上,诱导冠瘿瘤,并能合成冠瘿(opine),作为农杆菌碳源和氮源。
Ti质粒及其衍生载体
   




  * Ti质粒特点:
  1. 具有五个主要功能区域:
  ①. T-DNA:LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组;
  ②. 质粒转移区(PT);
  ③. 冠瘿碱(opine)代谢区;
  ④. 复制原点;
  ⑤. 毒性区。
  2. T-DNA中直接参与转移并整合的序列:T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复,右端的这段序列称为右界(RB),左端的序列称为左界(LB)。
  3. V区的毒性基因:T-DNA转移所必需,毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。

  * Ti质粒是200~500kb环状DNA分子,主要有两套载体系统:
  ⑴. 双元载体(binary vectors) :该系统具有两个质粒:
  ①. 用于克隆外源基因片段的克隆质粒:在E.coli和农杆菌中复制,容易操作,并可在二者间转移,是一种穿梭质粒;
  ②. 非致病质粒:具有毒性基因,没有T-DNA序列。
  将两个质粒分别导入进农杆菌中,经农杆菌介导,克隆质粒中的外源DNA转移到植物染色体中。
  ⑵. 共整合载体(intergrated vectors):
  这个系统包括两个质粒,一个用作克隆外源基因,另一个具有毒性基因,但这两个质粒具有一段同源序列,在农杆菌中重组整合成一个载体。
  四、基因的分离与鉴定:

  一般而言,一个基因是编码一条多肽链的一个DNA片段,包括启动子、终止子及内含子等。
  在DNA重组技术出现之前,由于DNA分子量大而结构单一,DNA是细胞中最难 分析的大分子。
  DNA重组技术发展成功之后,DNA已成为细胞中最易操作分析的大分子。
  DNA的体外重组:
  1.体外通过限制性内切酶的修剪和DNA连接酶的连接;
  2.目标DNA分子 + 载体 DNA,共价连接;
  3.获得重组DNA分子。

DNA的体外重组

  ㈠、从基因库中分离基因:
  1. 基因库(gene library):
  是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因,首先要构建基因库。
  根据克隆核酸序列、来源,基因库可分为:核基因库、染色体库、cDNA库、线粒体库等。

基因库

  ①. 核基因库 :
  核基因库(genomic library):将某生物全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成。 
  构建文库可采用不同的载体:
  质粒载体:重组质粒导入感受态细胞收集菌落。
  噬菌体或柯斯质粒 (cosmid)载体:将重组DNA包装进噬菌体感染细菌收集噬菌斑。
  BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体:重组人工染色体导入宿主细胞收集细胞。
  ②. 染色体基因库:
  将染色体用来构建基因库,可选择特异基因和分析染色体结构和组织。
  如果蝇的多线染色体:对染色体进行微切割,可以构建染色体区段的基因文库。


  人类基因组项目研究中,利用流动细胞分离(flow cytometry)技术将人类染色体分开构建单个染色体基因库加速人类基因组作图和分析。

流式细胞分离原理
分离染色体进行涂色验证

  酵母菌:
  利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electro-phoresis, PFGE) ,将酵母菌16根染色体依据其分子量
大小分开后,用于构建染色体库,在基因组的分析中发挥作用。
  ③. cDNA库:
  以mRNA为模板反转录酶合成互补DNA构建基因库。
  真核生物mRNA3’端有一段多聚A尾端双链DNA分子经两端补齐以带限制性酶切点的人工接头连接酶切后与载体(通常是噬菌体)连接制备cDNA库。
  cDNA库与核DNA库不同:
  cDNA库仅具有细胞或组织内表达基因的mRNA序列仅包括基因组的部分基因序列。

  2. 筛选基因库:

  根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件从基因库中筛选、分离基因。
  多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe),用放射性同位素或非放射性同位素标记探针筛选基因库。
  筛库过程:
  将噬菌体感染形成的噬菌斑印影在硝酸纤维膜上变性带有目的基因的放射性DNA或cDNA作探针进行杂交放射性自显影杂交信号(黑点)对应的噬菌斑即为阳性克隆。

  3. 阳性克隆的分析与鉴定:

  从基因库中筛选出阳性克隆分析、鉴定得到目的基因。
  ⑴. 限制性酶图谱:
  构建阳性克隆的限制性酶图谱根据同源性分析,了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置用于进一步亚克隆或同已知的其它序列比较。

  下图为一个 15kb DNA片段的限制性酶图谱构建方法。

筛选基因库

限制性酶图谱构建

  不同DNA用限制性酶酶切,根据其产生的多型性,即限制性酶片段长度的多型性来分析DNA水平的变异程度,以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。

  ⑵. 核酸分子杂交:
  ①.Southern杂交分析:
  由英国Southern (1975)发明,将琼脂糖中的DNA转移到尼龙膜进行DNA分子杂交分析的方法。
  筛选基因库得到阳性克隆将限制性酶酶切Southern杂交结合绘制限制性酶图谱。
 
核酸分子杂交
转膜

  ②. Northern杂交分析:与Sorthern杂交的原理和程序相同。
  用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平,检测mRNA的存在。

检测mRNA

  ③. Western 杂交分析:用于蛋白质的分析。

Western 杂交分析

  ⑶. 核酸序列测定:
  测定克隆后的DNA片段核酸序列 。
  一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法测定核酸序列。

核酸序列测定

  在Sanger双脱氧法中,可用荧光标记来代替放射性标记:

荧光标记来代替放射性标记
荧光标记来代替放射性标记

  ⑷. 核酸序列分析:
  测定的核酸序列是否为基因、有什么功能,需用计算机软件或生物学实验进一步分析。
  ①.同源序列的分析:
  * 同源性比较:
  将待测序列在核酸和蛋白质两个水平上比较基因间的同源性,将序列发送到Blast等DNA Data数据库进行比较。
  * 阅读框架的分析:
  一个ORF是一条能编码一条多肽链的DNA序列,具有翻译起始信号和终止信号等。
  cDNA 序列可分析内含子等。
  ②.无任何同源性的新序列:
   进行基因功能性研究的方法:
  * 将基因导入生物体进行基因失活或过量表达,根据表型推测基因作用;
  * 用噬菌体显现(phage display)技术;
  * 酵母双杂交系统进行蛋白质的功能分析。

  ㈡、PCR扩增基因:
  聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,PCR)可以体外快速扩增DNA。
  美国Mullis(1986)发明 (现代生物学发展史上的里程碑)。

  PCR反应三个步聚 (一个循环):
  1. 变性:94-95℃使模板DNA双链变成单链;
  2. 复性:50-70℃下,引物分别与互补DNA单链互补配对;
  3. 延伸:在引物的引导和Taq酶作用下,72 ℃下合成模板DNA的互补链。
  PCR反应通常有25-35个循环,一般可扩增5kb左右的片段。
  由该技术衍生出一些新的技术,如RAPD和AFLP等技术。

PCR反应

  ㈢、人工合成基因:

  根据已知的基因或氨基酸序列,将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成 DNA的方法结合起来可很快地人工合成基因。
  如SOE-PCR(sequence overlapped extension,SOE)技术可扩增出完整的基因序列。
  1. 化学合成的寡聚核苷酸(80-100个核苷酸)通过SOE将单链部分补齐;
  2. PCR扩增DNA片段;
  3. DNA变性;
  4. 两个单链部分经SOE补齐双链;
  5. PCR扩增DNA,利用多级SOE-PCR 扩增出完整的基因。
  五、基因工程的应用:

  目前,基因工程研究发展迅速,已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域,为人类创造了巨大的财富。
  左下图为转基因的方法和技术。

转基因的方法和技术

  ㈠、基因工程工业:
  最早应用基因工程生产人的蛋白质的方法是在细菌中表达人的胰岛素(1982)。
  基因工程生产人的胰岛素的方法如左下图所示。
  现已在细菌中生产10多种药品,例如表皮生长因子、人生长激素因子、干扰素、乙型肝炎工程疫苗等。
  目前,酵母菌、植物悬浮细胞、植株和动物培养细胞均成功地应用于表达外源蛋白。
  右下图为基因工程应用大肠杆菌生产人类生长激素。

生产人的胰岛素
生产人类生长激素

  ㈡、植物基因工程:
  植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。
  许多植物基因已经被分离、克隆。
  农杆菌转化法和基因枪转化法应用最多。

抗虫稻
抗虫棉

  1. 根癌农杆菌转化技术:
  根癌农杆菌介导的植物转化技术应用最早(双子叶植物单子叶植物)。
  过程:将目的基因与启动子(花椰菜病毒35S)及终止子组成嵌合DNA分子插入到Ti衍生质粒RB与LB内构成重组质粒转化农杆菌细胞利用重组农杆菌去感染植物细胞使质粒部分DNA包括目的基因,整合到植物染色体,实现遗传转化。
  利用抗草甘磷(glyphosate) E. coli中分离克隆的EPSP合成酶基因,已培育出高抗除草剂转基因植物。
  农杆菌转化法:

农杆菌转化法

  2. 基因枪转化技术:
  以高压气体为动力,高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒将目的基因直接导入植物细胞整合到染色体上。
  转化的载体多以pUC系列质粒为基础构建通常具有细菌复制原点及抗性选择标记、可在植物中表达的启动子终止子及调控序列、植物抗性选择标记(如除草剂、潮霉素等抗性)。

基因枪转化

  ㈢、转基因动物:
  转基因动物:目的基因载体重组DNA微量注射法将重组DNA导入受体合子细胞核遗传转化。
  如:
  利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。
  可分泌人类生长因子Ⅸ的转基因羊“Polly” 。
  下图为《Wilmut等,Nature 385, 1997》。


  左下图为受精卵细胞注射法,右下图为转基因牛(受精卵注射法)。

受精卵细胞注射
转基因牛

下图中左边小白鼠为转移有人类生长
激素转基因鼠,右边为同胞鼠对照。
下图中的猪为人类生长激素转基因猪
转基因鼠
转基因猪

  ㈣、遗传疾病诊断:
  利用重组DNA技术进行遗传疾病诊断,是直接从DNA即基因水平进行诊断准确度高,速度快。
  如进行产前诊断,分析胎儿是否有遗传疾病。

羊膜穿刺术
RFLP法

  1. RFLP法(右上图):
  ①. 原理:限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。
  某位点核苷酸序列发生突变有可能导致缺失或产生新的限制性酶切位点。
  若突变只发生在同源染色体的一条上,另一条正常,限制性内切酶酶切DNA片段带型可用于鉴别同源染色体的差异。
  酶切后产生的DNA片段长度的差异,称为限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms,RFLP)。
  RFLP差异具有共显性特点。

  ②. 镰刀性贫血病的诊断:
  该病由-球蛋白基因一个核苷酸突变(由GAG变成GTG)导致的,这个核苷酸改变也正好导致一个限制性酶切位点改变。
  杂合体经酶切产生带型差异,识别该位点。

限制性酶切位点改变
镰刀性贫血病的诊断

  2.等位基因特异寡核苷酸法(allele-specific oligonucleotide,ASO)
  当已知突变基因的核苷酸序列时,可用人工合成的寡核苷酸进行PCR反应,将PCR产物用作点杂交分析,鉴定基因型。
  这种用于检测单个核苷酸变异的方法,称为ASO法。
  许多遗传疾病可用该法诊断。
  参看右图:从血液细胞中提取DNA分别用正常及突变的ASO进行PCR,杂交后的两种结果。
  A:用正常基因(βA)的ASO进行PCR时,三种基因的信号强度。
  B:用突变基因(βS)的ASO进行PCR时,三种基因的信号强度。
鉴定基因型

  ㈤、基因治疗:
  特异基因导入并整合到有遗传缺陷患者基因组中治疗遗传疾病,通常叫做基因治疗(gene therapy)。
  方法:减毒的病毒DNA作载体(retro virus DNA)构建重组DNA分子用病毒包装物包装后形成的减毒病毒感染患者的细胞将正常基因整合到染色体上。
  例如,用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的减毒病毒载体,已用于治疗严重综合免疫缺陷(SCID)。
  SCID是由于腺苷脱氨酶基因(adenosine deaminase,ADA)突变引起,患者无任何免疫功能。
  2000年法国Fischer用该方法治愈患有SCID遗传病的两个婴儿(8个月和
11个月)被认为是20世纪人类基因治疗上的重大突破。
  方法:将ADA基因导入到MLV retro virus 载体取代该病毒DNA中的三个基因结构(gag、pol、env)将重组后的病毒去感染T细胞,使ADA基因整合到T细胞的染色体中实现基因治疗的目的。
基因治疗

基因治疗

  ㈥、DNA芯片(DNA chips) :
  核酸分子杂交的原理和方法半导体技术结合形成的一门新技术。这一技术可使许多分子杂交反应同时进行。


  DNA芯片技术:
  在小面积(如2cm2)基片表面分成不同小格有序点阵排列在一定位置、可寻址的核苷酸分子将待分析核苷酸分子标记(如用荧光),变性成单链与芯片上序列相同的核苷酸分子杂交与芯片上序列不同的核酸分子被洗掉利用高精度的激光扫描仪记录分子已杂交的荧光信号计算机软件分析。

DNA芯片

  拟南芥48种cDNA经PCR扩增,微点样制成96孔cDNA芯片野生型和HAT4突变型mRNA探针分别用荧光素和丽丝胺标记,将两探针以1:1比例混合并杂交于同一芯片分别用该两种荧光素激发波长进行扫描得到C、D图。
  桔红色越深,基因表达丰度越高。E、F图也相同。

拟南芥48种cDNA

  DNA芯片的基片:玻璃、硅片或尼龙等。
  DNA芯片从几千个微点(用同位素标记)发展出160万点阵的芯片(荧光素标记)。
  应用领域:
  基因多态性检测(如单核苷酸多态性筛选,single nucleotidepolymorphisms,SNPs) ;
  基因表达分析(不同细胞和不同组织的RNA群体比较);
  克隆选择及文库筛选(如cDNA文库);
  基因突变检测及遗传病和肿瘤的诊断等。

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