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第三节 植物的组织培养
作者:植物生理…    文章来源:扬州大学农学院    点击数:3879    更新时间:2007/7/4
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一、组织培养的意义和分类
  (一)组织培养的概念与分类
  植物组织培养(plant tissue culture)是指植物的离体器官、组织或细胞在人工控制的环境下培养发育再生成完整植株的技术。用于离体培养进行无性繁殖的各种植物材料称为外植体(explant)。根据外植体的种类,又可将组织培养分为:器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等(图8-12)。

  图 8-12由高等植物的细胞、组织和器官培养成植株的过程。
  1.器官培养 包括根、茎、叶、花器官及其原基的培养,其中茎尖培养具有快速繁殖和去除病毒的优点。
  2.花药和花粉培养 花药是花的雄性器官,花药培养属器官培养;花粉是单倍体细胞,花粉培养与单细胞培养相似,花药和花粉都可以在培养过程中诱导单倍体细胞系和单倍体植株。单倍体植株经过染色体加倍就成为纯合二倍体植株,这样可缩短育种周期,获得纯系。花培已成为植物育种的一种重要手段。
  3.组织培养 包括分生组织、形成层组织、愈伤组织和其他组织的培养。愈伤组织 (callus)原来是指植物受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞,在组织培养中则指在培养基上由外植体长出一团无序生长的薄壁细胞。愈伤组织培养是最常见的培养形式,因为除了一部分器官,如茎尖分生组织、原球茎外,其他各种培养形式往往都要经过愈伤组织培养与诱导后才产生植株。
  4.胚胎培养 包括原胚和成熟胚培养、胚乳培养、胚珠和子房(未授粉或已授粉的)培养,可用于研究胚胎发生以及影响胚生长的因素;用试管受精或幼胚培养可获得种间或属间远缘杂种,因此它也是研究生殖生理的有用方法;胚乳培养是研究胚乳的功能、胚乳与胚的关系,以及获得三倍体植株的一个手段。
  5.细胞培养 包括单细胞、多细胞和细胞的遗传转化体的培养。细胞培养也称细胞克隆(cell clone)技术,它培养单离的细胞,可诱导再分化,用于取得单细胞无性系,进行突变体的选育。至今已有多种生物发生器(bioreactor)用于批量培养增殖细胞,这些发生器可分为两大类:悬浮培养(suspension culture)发生器和固相化细胞(immobilized cells)发生器,前者的细胞处于悬浮、可动状态,而后者的细胞包埋于支持物内,呈固定不动的状态。
  6.原生质体培养 包括原生质体、原生质融合体和原生质体的遗传转化体的培养。将去壁后裸露的原生质体进行培养,它易于摄取外来的遗传物质、细胞器以及病毒、细菌等,常应用于体细胞杂交和转基因的研究。
  (二)组织培养的历史与意义
  植物组织培养的理论基础建立在植物细胞全能性(totipotency)的概念上。植物细胞的全能性是指植物的每个具有核的细胞都具备母体的全部基因,在一定的条件下可以发育成完整的植株。早在1902年德国植物学家哈伯兰特(G. Haberlandt)根据细胞学说就提出植物体细胞有再生完整植株的潜在可能性。1934年美国的怀特(White)等培养离体番茄根尖,建立了可以继代培养(subculture)的第一个无性繁殖系。20世纪40年代末崔利用腺嘌呤诱导烟草组织培养形成芽和完整植株。1958年斯图尔德(Steward)和赖纳特(Reinert)用胡萝卜根的愈伤组织诱导成了体细胞胚,并进而获得了完整植株。1960年科金(Cocking)等用真菌纤维素酶分离番茄幼根原生质体获得成功。1964年古哈(Guha)等从曼陀罗花药中得到了单倍体植株。1971年塔克伯(Takebe)等用烟草叶肉细胞分离原生质体,并再生完整植株;以后中国学者在水稻、玉米、小麦、高梁和大麦等农作物的原生质体培养中相继成功地获得了它们的再生植株。原生质体的培养为体细胞融合技术的发展创造了条件。1972年卡尔森(Carlson)等通过两个烟草品种之间原生质体的融合,获得了第一个体细胞杂种。1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种——“Potamato”。进入20世纪80年代后,生物工程迅速发展,通过某种途径或技术将外源基因导入植物细胞并使之表达,可实现植物遗传改良的目的。组织培养的优点在于:可以在不受植物体其它部分干扰下研究被培养部分的生长和分化的规律,并且可以利用各种培养条件影响它们的生长和分化,以解决理论上和生产上的问题。有力地推动了生物科学中植物生理学、生物化学、遗传学、细胞学、形态学以及农、林、医、药等各门学科的发展和相互渗透,促进了营养生理、细胞生理和代谢、生物合成、基因转移、基因重组的研究。当前组织培养作为生物工程的一项重要技术,在基础理论研究和生产实践中发挥的作用与日俱增,可望为造福人类作出贡献。

二、组织培养的基本方法
  (一)材料准备
  尽管已确立了植物细胞全能性的理论,但实践中,全能性表达的难易程度在不同的植物组织之间有着很大的差异。将同一植株不同器官作为外植体诱导愈伤组织,它们的分化频率和模式与来源器官有关。由根、下胚轴及茎形成的愈伤组织分化成根的频率很高;由叶或子叶形成的愈伤组织分化成叶的频率很高;由茎端形成的愈伤组织分化成芽与叶的频率亦很高;靠近上部的茎段与接近基部的茎段相比能形成较多的花枝和较少的营养枝。这说明外植体的发育状态在组织分化中有“决定”作用的存在。决定(determination)这一术语是指植物发育过程中细胞逐渐成为具有特异专一性倾向的过程,这个过程具有稳定的表型变化,而且这些变化在原初刺激消失时还能存在。因此要根据研究目标,有针对性地选择材料。一般来说,受精卵、发育中的分生组织细胞和雌雄配子体及单倍体细胞是较易表达全能性的。
  通常采集来的材料都带有各种微生物,故在培养前必须进行严格的消毒处理。常用的消毒剂有70%酒精、次氯酸钙(漂白粉)、次氯酸钠、氯化汞(HgCl2,升汞)等。消毒所需时间长短依外植体不同而异,消毒后需用无菌水充分清洗。
  (二)培养基制备
  培养基(medium)中含有外植体生长所需的营养物质,是组织培养中外植体赖以生存和发展的基地。White培养基是最早的植物组织培养基之一,被广泛用于离体根的培养;MS(Murashige和Skoog,1962)培养基含有较高的硝态氮和铵态氮,适合于多种培养物的生长;N6培养基含有与MS差不多的硝态氮,但铵态氮仅为MS的1/4多一些,特别适合于禾本科花粉的培养;B5培养基则适合于十字花科植物的培养。总之,应根据培养的目的选择一种适宜的培养基。常见的培养基配方如表8-1所示。
  1. 培养基成分 培养基的成分大致可分五类:
  (1)水 一般用蒸馏水或去离子水配制培养基,煮沸过的自来水也可利用。
  (2)无机营养 包括大量和微量必需元素,对硝酸铵等用量较大的无机盐通常先按配方表配成10倍的混合母液。植物必需微量元素因用量小,常配成100倍或者1000倍的母液。
  (3)有机营养 主要有糖、氨基酸和维生素。糖为培养物提供所需要的碳源,并有调节渗透压的作用。常用的是2%~4%的蔗糖,有时也加入葡萄糖和果糖等。一般来说,以蔗糖为碳源时,离体的双子叶植物的根长得较好,而以葡萄糖为碳源时,单子叶植物的根长得较好。已知植物能够利用的其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖,有的还能利用淀粉。
  维生素和氨基酸类的物质,主要有硫胺素(维生素B1)、吡哆素(维生素B6)、烟酸(维生素B3)、泛酸(维生素B5)以及甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、肌醇和水解酪蛋白等。

  (4) 天然附加物 有时还加一些天然的有机物,如椰子乳、酵母提取物、玉米胚乳、麦芽浸出物或番茄汁等。它们对愈伤组织的诱导和分化往往是有益的。
  (5) 植物生长物质 常用的有生长素类和细胞分裂素两类。生长素类如2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸等被用于诱导细胞的分裂和根的分化。IAA易被光和酶氧化分解,所以加入的浓度较高,常为1~30mg·L-1,NAA、2,4-D的浓度则以0.1~2mg·L-1为宜;细胞分裂素如激动素、6-苄基腺嘌呤、异戊烯基腺嘌呤、玉米素等可以促进细胞分裂和诱导愈伤组织或器官分化不定芽。它们常用的浓度为0.01~1mg·L-1。在初代培养中,一般都须加入激素类物质,但随着继代培养次数的增加,加入量可逐代减少,最终常可做到“激素自养”。离体培养物的根芽分化取决于生长素/细胞分裂素的比值(见图8-11)。吲哚乙酸以及酶和维生素C等因在高温高压灭菌时易遭破坏,故使用时以过滤或抽滤灭菌为好。
  2. 培养方式 植物组织培养方式有固体培养和液体培养两种。通常在液体培养基中加入0.7%~1%的琼脂作凝固剂,便成了固体培养基。固体培养使用方便,能满足多种目的的培养的需要,且培养基质地透明,便于观察发根状况,因此得到广泛的应用。液体培养分静止和振荡两类,静止培养不需增添专门设备,适合于某些原生质体培养;而振荡培养需要摇床或转床等设备,在振荡培养过程中,可使培养基充分混和,也可使培养物交替地浸没在液体中或暴露在空气中,有利于气体交换。通常半月至1月后须移换新鲜培养基。
  (三)接种与培养
  1.接种 接种是指把消毒好的材料在无菌的情况下切成小块并放入培养基的过程。接种时一定要严格做到无菌操作,一般在接种室、接种箱或超净工作台中进行。
  2.愈伤组织的诱导 植物已经分化的细胞在切割损伤或在适宜的培养基上可以诱导形成失去分化状态的结构均一的愈伤组织或细胞团,这一过程即为脱分化(dedifferentiation)。一般诱导愈伤组织的培养基中含有较高浓度的生长素和较低浓度的细胞分裂素。外植体一旦接触到诱导培养基,几天后细胞就出现DNA的复制,迅速进入细胞分裂期。细胞的分裂增殖,使得愈伤组织不断生长。如果把处在旺盛生长且未分化的愈伤组织切成小块进行继代培养,就可维持其活跃生长。经过多代继代培养的愈伤组织还可用于悬浮培养,用作单细胞培养研究、细胞育种和分离原生质体等。无论是固体培养还是液体培养,都须控温在25±2℃之间。除某些材料诱导愈伤组织需要黑暗条件外,一般培养都需一定的光照,光源可采用日光灯或自然光线,每天光照约16h,光强为20 000lx左右。
  3.器官形成或体细胞胚发生 愈伤组织转入诱导器官形成的分化培养基上,可发生细胞分化。分化培养基中含有较高浓度的细胞分裂素和较低浓度的生长素。在分化培养基上,愈伤组织表面几层细胞中的某些细胞启动分裂,形成一些细胞团,进而分化成不同的器官原基。器官形成过程中一般先出现芽,后形成根。如果先出现根则会抑制芽的出现,而对成苗不利(图8-12)。有时愈伤组织只形成芽而无根的分化,此时须切取幼芽转入生根培养基上诱导生根。生根培养基一般用1/2或1/4的MS培养基,再添加低浓度的生长素而不加细胞分裂素。这种由处于脱分化状态的愈伤组织或细胞再度分化形成不同类型细胞组织、器官乃至最终再生成完整植株的过程称为再分化(redifferentiation)。
  在特定条件下,由植物体细胞发生形成的类似于合子胚的结构称为胚状体(embryoid)或体细胞胚(somatic embryo),简称体胚。胚状体最根本的特征是具有两极性,即在发育的早期阶段能从方向相反的两端分化出茎端和根端,而不定芽或不定根都是单极性的。胚状体由于具有根茎两个极性结构,因此可以一次性再生完整植株。而由器官发生的植株则一般需要先诱导成芽,再诱导芽生成根,形成植株。胚状体发生及其再生的过程是植物表达全能性的有力证明,也是获得再生植株最理想的途径。胚状体发生的方式可分为直接发生和间接发生两类,直接发生是指从原外植体不经愈伤组织阶段直接的;而间接发生是指胚状体从愈伤组织、悬浮细胞或已形成的胚状体上发育来的。
  (四)小苗移栽
  当试管苗具有4~5条根后,即可移栽。移栽前应先去掉试管塞,在光线充足处炼苗。移栽时先将小苗根部的培养基洗去,以免招细菌繁殖污染。苗床土可采用沙性较强的菜园土,或用泥炭土、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等调配成的混合培养土。用塑料薄膜覆盖并经常通气,小苗长出新叶后,去掉塑料薄膜就能成为正常的田间植株。

三、组织培养的应用
  植物组织培养在科研和生产上的应用十分广泛,简介如下:
  (一)无性系的快速繁殖
  快速繁殖是组织培养在生产上应用最广泛、最成功的一个领域。对上千种植物离体繁殖得到了无性系,并带来了巨大的经济效益,不少国家成立了专业公司,形成一种产业。无性系繁殖植物的主要特点是繁殖速度快。通常一年内可以繁殖数以万计的种苗,特别对于名贵品种、稀优种质、优良单株或新育成品种的繁殖推广具有重要的意义。离体繁殖良种种苗最早在兰花工业上获得成功。兰花成熟的种子中大多数胚不能成活,种子不能发芽,但通过原球茎组织培养,能使兰花的繁殖系数大为提高,从而形成了20世纪60年代风靡全球的“兰花工业”。甘蔗繁殖用种量大,1hm2需用半至7.5-15t的种蔗。采用茎尖、嫩叶组织培养繁殖种苗,节省了大量的种蔗,加速了优良品种的推广。其他如牡丹、香石竹、唐菖蒲和菊花等难以扦插的名贵品种以及无籽西瓜、草莓、猕猴桃、葡萄、菠萝、柑橘、樱桃、桉树、杉木等的无性系快速繁殖都取得了进展,有力地推动了生产。
  (二)培育无病毒种苗
  农作物受病原菌侵染后既影响产量和质量,也影响植物材料的国际交流。然而感病植株的不同部位病毒分布不一致,新生组织及器官病毒含量很低,生长点几乎不含病毒。这是由于分生组织的细胞生长快,病毒繁殖的速度相对较慢;而且病毒要靠筛管或胞间连丝传播,在分生组织中的扩散也受到一定的限制。茎尖越小,去病毒机会越大,但分离技术难度大,也较难成活。一般以0.2~0.5mm、带1~2个叶原基的茎尖为外植体,可获得无病毒株系。病毒病常使马铃薯减产50%左右。1990年中国马铃薯的无病毒种苗栽培面积已超过25万hm2,约占全国马铃薯栽培面积的1/10,目前仍在继续扩大之中。另外,在香蕉、苹果、甘蔗、葡萄、桉树、毛白杨、草莓、甜瓜、花卉上均通过试管脱毒,建立了试管苗工厂及无病苗圃。
  (三)新品种的选育
  组织培养在品种改良、新种质资源的提供、新品种的选育方面涉及和应用的范围十分广泛,并已取得了成效。
  1.花培和单倍体育种 花药和花粉培育的主要目的是诱导花粉发育形成单倍体植株,以便快速地获得纯系,缩短育种周期、且有利于隐性突变体筛选,提高选择效率。中国科学院遗传研究所于1970年获得第一批水稻花药培养形成的幼苗,1971年又获得小麦花药培养的单倍体植株。近年来已有烟草、水稻、小麦、大麦、玉米和甜椒等一大批花培优良新品种在生产上大面积推广。
  花粉粒培养可使配子体的生长恢复为孢子体的生长,生长出单倍体植株
  图8-13 电融合法的装置、基本顺序和原理
  1.在两电极间(1mm)放入原生质体悬液; 2.给电极施加高频(1MHz)交流电压(如300V·cm-1),40sec,原生质体表面电荷重新分布,具有正负极性,因相互吸引,使多个原生质体排成串珠(pearl chain)状; 3.施加一次直流脉冲电压(如2.0kV·cm-1 ,30μsec),串珠间的原生质体质膜局部破裂,脂质分子重新排列,引起质膜融合; 4.断电,已融合的原生质体在膜张力的作用下逐渐成为球状,未融合的细胞被分开。
  2.离体胚培养和杂种植株获得 这是用于克服远缘杂交不亲和的一种有效方法。例如,棉花远缘杂交杂种胚胎发育过程中,胚乳生长不正常,致使幼胚分化停止,如将杂交授粉后2~5d的胚珠进行离体培养,可使胚发育成杂种植株。至今,用胚培养技术已得到许多栽培种与野生种的种间杂种,并选育出一批高抗病、抗虫、抗旱、耐盐、优质品系或中间材料,从而扩充了作物的基因库。
  3.体细胞诱变和突变体筛选 植物细胞存在着广泛的异质性,在整体中常被掩盖而无法表现出来。在离体培养条件下,它不受整体的调控直接与环境接触,而且培养基中的化学成份和植物激素,又可能含有诱变因素或促进突变的条件,因此植物体细胞在离体培养条件下容易发生染色体畸变与基因突变。如果再加上物理或化学诱变处理,则诱发突变的机率更高。物理诱变的因素有 X 射线、α射线、β射线、γ射线、中子、质子和紫外线等。化学诱变的因素有烷化剂、亚硝酸、羟胺、天然碱基结构类似物以及某些抗菌素等。目前,筛选出的突变品系已在十几种作物的改良中得到了应用。如早熟、丰产的水稻和小麦新品系;高产多穗的玉米新品系以及抗白叶枯病的水稻;抗赤霉病或根腐病的小麦;高赖氨酸含量的玉米和大麦;抗早疫病的番茄;耐枯黄萎病、耐高温、耐盐的棉花新品系;抗晚疫病、枯萎病的马铃薯突变系以及抗除草剂的烟草品系等等。
  4.细胞融合和杂种植株的获得 细胞融合(cell fusion)是指在一定的条件下,将2个或多个细胞融合为一个细胞的过程。当前,细胞融合已成为遗传转化实验最有效的手段之一。用纤维素酶、半纤维素酶和离析酶等离析细胞以获得纯净的原生质体。原生质体脱掉了细胞壁后,易于诱导融合,也易于摄取外源遗传物质、细胞器等。通过原生质体融合可以部分克服远缘杂交中的不亲和性,提供新的核质组合,创造新的细胞杂种,为进一步选种育种扩展新的资源。对那些有性生殖能力很低的香蕉、木薯、马铃薯、甘薯和甘蔗等作物的改良,体细胞杂交可能具有更为特殊的意义。最初(1985年)采用聚乙二醇(PEG)等化学融合剂进行细胞融合,因化学融合剂对原生质体易引起伤害,现已不用,而大多采用电融合法,即将需处理的原生质体放在两电极中,并用一定强度的电脉冲将质膜击穿,以导致原生质体融合(图8-13)。目前,已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代,获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。
  (四)人工种子和种质保存
  人工种子(artificial seeds) 又称人造种子或超级种子,是指将植物组织培养产生的胚状体、芽体及小鳞茎等包裹在含有养分的胶囊内,具有种子的功能并可直接播种于大田的颗粒。人工种子通常由培养物、人工胚乳和人工种皮三部分组成(图8-14)。人工种皮常采用海藻酸钠、聚氯乙烯、明胶、树胶等。人工种子可解决有些作物繁殖能力差,结籽困难或发芽率低等问题,使像无籽西瓜一类的不育良种得以迅速推广;有利于保持杂种一代高产优势,防止第二代退化;在制作过程中可以添加农药、肥料、固氮细菌等各种附加成份,以利作物生长;还可以节约用作种子的粮食。制作人工种子首先要培养大批同步生长的、高质量的胚状体、芽体(不定芽、腋芽、顶芽)等培养物。现在已有胡萝卜、芹菜、柑橘、咖啡、棉花、玉米、水稻、橡胶等几十种植物的人工种子试种成功,但由于成本较高,中国尚未应用于生产。
  图8-14 制作人工种子的示意图
   左图:制作人工种子的一种方法:1.双重管的外管内含有海藻酸钠,内管中放入胚状体和培养液,先从外管放出少量海藻酸钠,使双重管的下端形成半球; 2.从内管中放入含有不定胚的培养液(含保水剂); 3.再从外管放出一点海藻酸钠,形成球状液滴; 4.将液滴滴入50mmol·L-1 CaCl2水溶液(含杀菌剂); 5.放置一定时间,使海藻酸钠外层形成不溶于水的海藻酸钙膜; 6.播种后人工种子的发芽。右图:人工种子的构造示意图。(西村,1990)
   近些年来,对于植物材料超低温保存及其种质库的建立也取得了重要进展。超低温种质保存就是将植物材料保存在液氮(-196℃)条件下,使它们处在长期冰冻状态,而不失去生长和形态建成的潜力。超低温植物材料的保存可以减少培养物的继代次数,节省人力物力,解决培养物因长期继代培养而丧失形态建成能力的问题。一般认为,采用有组织结构的材料,如茎尖、幼胚和小苗等作保存材料,其遗传性较为稳定,易于再生。
   (五)药用植物和次生物质的工业化生产
   植物是许多有用化合物的重要来源,有些尚供不应求。目前植物细胞的大量培养主要用来生产药物和次生代谢物质,如抗癌药物、生物碱、调味品、香料、色素等。运用组织培养生产化学物质可以不受地区、季节与气侯等限制,便于进行代谢调控和工厂化生产,生产速度也比植物正常生长的速度快。例如日本大量培养人参细胞,并从中取得人参皂甙等有效成分,德国培养洋地黄取得疗效高、毒性低的强心甙,中国正在进行人参、三七、三分三、贝母、紫草、紫杉等,药用植物的细胞培养,其发展前景十分诱人。
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