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2.2 DNA的二级结构及多态性
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:9449    更新时间:2011/4/15
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2.2.1 DNA的双螺旋结构

2.2.1.1 双螺旋结构建立的依据

Watson和Crick在1953年以立体化学上的最适构型建立了一个与DNA X-射线衍射资料相符的分子模型——DNA双螺旋结构模型。 它可在分子水平上阐述遗传(基因复制)的基本特征。

 

DNA双螺旋结构的主要依据:

多核苷酸的特定序列是遗传信息所在。

Watson和Crick集各项DNA研究成果于一体,提出了双螺旋结构的模型。对建立DNA 双螺旋结构有直接影响的主要有两方面的依据:

Chatgaff对不同来源的DNA进行了碱基定量分析,得出了组成DNA的四种碱基的比例关系。Franklin和Wilkins用X-射线衍射方法获得的DNA结构资料。

 

①       1949-1951年Chatgaff应用紫外分光光度法和纸层析等技术,对不同来源的DNA进行碱基定量分析,得出组成DNA四种碱基的比例关系。

 

碱基组成的共同规律:

不同来源的DNA中[A]=[T]、[C]=[G];A+G=T+C 。

不同物种组织DNA在总的碱基组成上有很大的变化,表现在A+T/G+C比值的不同, 但同种生物的不同组织DNA碱基组成相同。

 

②Rosalind Franklin和Wilkins用X-射线衍射方法获得的DNA结构资料。

X-射线衍射技术是一种在原子水平上间接观测晶体物质的分子结构的方法(分辨率1´10-9m)。

 

利用DNA纤维晶体得到精确反映DNA某些结构特征的X-射线衍射图片。

影像表明了DNA结构的螺旋周期性,碱基的空间取向等。

 

2.2.1.2 双螺旋结构特征

①主链(backbone):脱氧核糖和磷酸基通过酯键交替连接成反向平行的两条主链,它们绕一共同轴心向右盘旋形成双螺旋构型。

主链处于螺旋的外则。

 

②碱基对(base pair):碱基位于螺旋的内则,它们以垂直于螺旋轴的取向。

同一平面的碱基在二条主链间形成碱基对。 A-T、G-C。间以氢键配对。

 

③大沟和小沟:大沟和小沟分别指双螺旋表面凹下去的较大沟槽和较小沟槽。小沟位于双螺旋的互补链之间,而大沟位于相毗邻的双股之间。

 

 

大沟和小沟是从螺旋轴心到两条主链划分出的两个不等扇形形成的,这两条沟,特别是大沟对蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息非常重要,只有在沟内蛋白质才能识别到不同碱基顺序。

 

④结构参数:螺旋直径2nm;螺旋周期包含10bp;螺距3.4nm;相邻碱基对平面的间距0.34nm。

 

2.2.1.3影响双螺旋结构的因素

①氢键

碱基存在供氢体(氨基和羟基)以及受氢体(酮基和亚氨基),它们之间可形成氢键。

在双螺旋中嘧啶和嘌呤之间的距离正好与一般氢键的键长(0.27nm)相一致。且供体氢原子和受体原子处于一直线上,利于形成氢键。

 

单个氢键是不稳定的,分子平均的键能仅2.5KJ/mol。因此,DNA双螺旋结构中的氢键处于不断的断裂和复合的热平衡状态,但由20个以上的碱基对组成的双螺旋在室温下已相当稳定。由于这个原因在设计PCR引物时,一般至少在16nt,以使其较为稳定,但最好在20~24个nt,以增加特异性。氢键的形成有助于DNA复制、修复、重组、转录、翻译,以及各种分子杂交等。

 

G-C间有三个氢键,A-T间只有2个氢键。这可用DNA的熔解温度Tm与(G+C)%含量成正比来证明。

根据Marmur-Doty关系式,在(G+C)%含量在30%到70%的范围内,0.15 mol/L NaCl+0.0l5 mol/L柠檬酸钠溶液中:

Tm=69.3十0.41(G十C)%

 

②碱基堆集力

碱基堆集力是同一条链中的相邻碱基之间的疏水作用力和Van der Waal力。

DNA的主链部分是亲水的,碱基的外围基团—氨基和酮基也是亲水的,但嘧啶和嘌呤本身带有一定程度的疏水性。因此在水溶液中这些疏水基团自发聚集。从热力学的角度来看,DNA顷向于形成三维结构是有利于高溶性的磷酸基团与水的接触增加到最大限度,使碱基与水的接触减少到最小限度,从而使双螺旋内部相邻碱基相互聚集,形成双螺旋,这是形成碱基堆集力的因素之一。

 

在双螺旋中相邻碱基对的间隔是0.34nm,而Van der waals力的半径(引力和斥力正好相平衡的距离)平均为0.17nm。 van der waal力加强了疏水作用力。

DNA链中的大量的嘌呤环和嘧啶环,其累积的van der waal力是相当可观的,是构成碱基堆积力的另一个重要因素。

 

在碱基堆集中,处于DNA中间的碱基比两端的稳定,两端碱基越多中间的堆集力越大,因此,DNA双链两端(3~7bp)经常绽裂(fraying)。某些具有单链特异性的脱氧核糖核酸酶,如BAL31,同时又具有双链核酸外切酶的活性,大概就是由双链末端的绽裂作用造成的。

 

DNA双螺旋结构中的疏水作用力可用加入甲醇(能增加碱基溶解度)或三氟乙酸钠(破坏碱基周围有序的水壳层)来证明。它们对磷酸-脱氧核糖骨架均无明显影响,但能显著降低Tm值,Tm值降低的程度恰恰与碱基溶解度的增加成比例。

 

用旋光色散(ORD)和圆二色性(CD)对单链DNA和RNA进行研究的结果表明,在单股多核苷酸中大部分碱基平行排列使长链成为有规则的螺线(helix)而不是无规则线团(random coil)。

甚至在二核苷酸中也发现了碱基平行排列的趋势,在DNA中则更是如此。这些都表明碱基堆积作用的存在。

 

许多结果都表明,多核苷酸倾向于有一个三维结构以使高度溶解的磷酸基团与水保持最大的接触而把碱基与水的接触减少到最低限度。这就是DNA中磷酸脱氧核糖链在外面而碱基在里面的原因。

 

由于碱基对间氢键的存在,双链DNA中的碱基比单链DNA中的碱些堆集程度更高。

当所有碱基指向正确的方向时,可达到最大的氢键键合。同样,若碱基不歪斜或摆动,则能提高碱基堆集作用。并且,已经堆集的碱基更易氢键键合;相应地,已被氢键定向的碱基更容易堆集。

因此,两种作用力相互协同形成稳定的结构。如果一种作用力被消除,则另一种作用力大为削弱。这是为何加入破坏其中一种作用力的试剂会使Tm 值急剧降落。

 

③带负电荷的磷酸基的静电斥力

DNA链上核苷酸的磷酸基上都带有一个负电荷,双链之间的这种强有力的静电排斥作用将驱使两条链分开。当有盐类存在时这些带负电荷的磷酸基团可被正离子(如Na+)所中和,即正离子在磷酸基周围形成的“离子云”屏蔽了磷酸基之间的静电斥力。

 

在生理盐浓度(约0.2mol/L)就可产生这种屏蔽作用。当离子浓度降低时,这种屏蔽作用减弱,斥力增大,因而Tm值随之降低。

这也是在纯蒸馏水中的DNA在室温下就会变性的缘故。在超过生理盐浓度时,Tm值仍然随着离子强度的增加而上升,这是因为在高盐浓度下碱基的溶解性降低而增加了疏水作用力,促进了双螺旋结构的稳定。

 

一般制备的DNA也总是DNA的钠盐,每个磷酸基结合一个Na+

证据:在用NaCl和CsCl测量DNA分子量时,会得到不同的数值,二者之比为0.75。因为单核苷酸的平均分子量为330,若是钠盐则为353,若是铯盐则为467。353/467=0.75。

 

④碱基分子内能

当由于温度等因素使碱基分子内能增加时.碱基的定向排列遭受破坏,削弱碱基的氢键结合力和碱基的堆集力,破坏DNA双螺旋结构。

 

因此,影响DNA双螺旋结构状态的因素中, 互补碱基间的氢键和相邻碱基的堆集力有利于DNA维持双螺旋构型,而磷酸基的静电斥力和碱基分子的内能则不利于DNA维持双螺旋构型。一种DNA分子的结构状态是四种因素竞争的结果。

 

2.2.1.4 DNA空间结构的不均一性

在DNA的一级结构中A、T、G、C四种碱基并非均匀分布,尽管双螺旋的构型大体相同,但沿着DNA长链各处的空间结构并不完全相同,各处双螺旋的稳定性有所差异,甚至在一定条件下改变了双螺旋的构象,如Z型DNA。即一级结构决定高级结构。

 

①反向重复序列(inverted repeats )

反复重复序列即回文序列(Palindrome)能在DNA或RNA中形成发夹结构,在DNA中有可能形成十字形结构。这是一个需能过程,一般在DNA水平上发生这种转变的可能性较小。

 

 

较短的回文结构可能是作为一种特别信号,如限制性内切核酸酶的识别位点。较长的回文序列容易转变为发夹结构,其功能目前还不完全清楚。但人们已经发现,转录的终止作用与回文结构有关。发夹环在tRNA的结构中也很重要,每一种tRNA都是出几个发夹环组成的三叶草形结构。

 

②富含A/T的序列

在高等生物中,A+T与G+C的含量差不多相等。然而在它们的染色体的某一区域, A.T含量可能很高。例如螃蟹的卫星DNA区段,A-T含量高达97%。它们仅仅重复AT两个碱基,即ATATATATATAT……;大约30个这样碱基才有时插入一个G或C(卫星DNA第九章讲述)。

 

在很多有重要调节功能的DNA区段都富含A-T, 5’-TA-3’的Tm值最低,例如在复制起点的序列中,富含A/T序列。启动子中(原核Pribnow框和真核TATA框,即Hogness 框)富含A/T对转录起始复合物形成有重要作用。

 

又例如,生命有机体选择UAA作为最有效的终止密码子是因为在64个三联体密码子中,它与反密码子(假定有的话)形成的互补产物的Tm值是最低的一个,即使在生理温度下也是不稳定的。在三种终止密码子中,UAG和UGA常会为突变型的tRNA无义抑制,而UAA则很少发生无义抑制也可能就是这个道理。这也就说明了为什么在肽链终止处常常会出现双重终止密码子(第六章讲述)。

 

 

③嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响

考察十种相邻的二核苷酸对(nearest-neighbor doublets),发现即使碱基组成相同,但嘌呤和嘧啶排列顺序不同,双螺旋的稳定性则有显著差异。

碱基间相互作用的强度与相邻碱基间环的重迭面积成正比。总趋势:嘌呤与嘌呤之间>嘌呤与嘧啶之间>嘧啶与嘧啶之间。

 

Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking

Step Definition: Going along one strand of DNA in 5’to 3’ direction

Four Possibles: P-Y, P-P, Y-P, Y-Y

 

Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking

 

例如5’-GC-3’的稳定性比5’-CG-3’ 大很多。虽然它们的氢键数目相同,而相邻碱基间的堆积力不同。即从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆集作用显著地大于同样组成的嘧啶到嘌呤方向的碱基推集作用。这是由于嘌呤环和嘧啶环间的重迭面积在不同形式的排列中不同。

2.2.1.5 DNA双螺旋结构是动态的

在DNA双螺旋结构中,配对碱基之间的氢键处于连续不断的断裂和再生的动态平衡之中。

 

甲醛变性试验证明在DNA中各碱基上的氨基总是形成氢键的,而甲醛只能和自由氨基起反应。甲醛能和DNA的氨基起反应使DNA发生不可逆变性,是因为当碱基之间氢键断裂时,甲醛才有机会与氨基起反应。由于断裂的氢键又可能立即恢复,甲醛要与全部氨基起反应需经过相当长的时间。

 

配对碱基间的氢键不但处于断裂和再生的平衡状态中,氢键上的氢原子还能和水发生交换,可用重水(3H2O)作溶剂得到证明。这进一步证明氢键的迅速地断裂和再生过程。特别是在富含A-T的节段更明显,经常发生瞬间的单链泡状结构,这对于某些特殊的蛋白质与DNA发生反应并阅读DNA链内部储藏的信息具有重要作用。

 

2.2.1.6 双螺旋结构的意义

① 确立了核酸作为信息分子的结构基础;

②提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式;

③确定了核酸是遗传的物质基础,为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用奠定了基础。

 

DNA的二条链是一对互补的模板(亲本),复制时两条链分开, 每条链都作为模板指导合成与自身互补的新链,最后从原有的两条链得到两对链而完成复制。

 

在严格碱基配对基础上的互补合成保证了复制的高度保真性。复制得到的每对链中只保留了一条亲链,称为半保留复制(semi-conservative replication)。

 

在满足二条链碱基互补的前提下,DNA的一级结构并不受限制。这一特征能很好的阐明DNA作为遗传信息载体在生物界的普遍意义。

实验证明半保留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。

 

2.2.2 DNA二级结构的多态性

DNA结构的研究手段主要是X射线衍射技术,它是通过间接观测多个DNA分子有关结构参数的平均值而获得的。

1953年Watson和Crick提出的DNA右手双螺旋模型基本上相当于B型。

B型是用生理盐浓度的DNA溶液抽成纤维,在92%的相对湿度下进行x光衍射测定出来的。除了B构象外人们还发现了A构象、C构象、D构象和E构象等右手双螺旋构象以及左手双螺旋的Z构象。

 

2.2.2.1 A-DNA和B-DNA

B-构象最常见的DNA构象,大量的工作证明了在溶液中的DNA确实是采取B构象。细胞中含有大量的水分,据信细胞DNA也是主要采取B构象。然而,细胞并不是均一的溶液,而且细胞中的DNA常常与蛋白质紧密结合,在某些区域发生构象上的改变是完全有可能的。

 

DNA的结构是可变的。

在以钠、钾或铯作反离子,相对湿度为75%时,DNA分子的X-射线衍射图显示的是A-构象。

A-构象不仅出现于脱水DNA中,还出现在RNA分子中的双螺旋区和DNA-RNA杂交分子和RNA-RNA双链中。

 

 

B-DNA与A-DNA的比较

 

 

 

 

 

 

DNA锂盐在相对湿度为66%,其构象为C-构象。这种构象仅在实验室中观察到。D构象和E构象仅适用于缺少G-C对的DNA分子,每圈螺旋的碱基对数分别为8和7.5。人工组建的poly(dA)、poly(dT)仍然是B构象,但其小沟明显变狭,这可能妨碍与组蛋白八聚体形成核小体结构。

 

DNA的构象是可变的,在不同的条件下构象不同。但这些DNA都是右手双螺旋;这些螺旋中都有两个螺旋沟,分为大沟与小沟,只是它们的宽窄和深浅程度有所不同。

 

2.2.2.2 Z-DNA

Wang和Rich等在研究人工合成的d(CGCGCG)单晶的X-射线衍射图谱时,发现这种六聚体的构象不同于B-构象。

它是左手双螺旋,在主链中各个磷酸根呈锯齿(Zigzag)状排列,因此称Z-构象。

 

Z-构象中的重复单位是二核苷酸;

Z-DNA只有一个螺旋沟,它相当于B构象中的小沟,它狭而深,大沟则不复存在。

 

 

 

B-DNA与Z-DNA的比较

 

 

①Z-DNA的结构特点

糖磷酸骨架呈“之”字形(Zigzag)走向。 Z-DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。这种排列方式会造成核苷酸的糖苷键的顺式和反式构象的交替存在。

 

当碱基与糖构成反式结构时,它们之间离得远;而当它们成顺式时,就彼此接近。

嘧啶糖苷键通常是反式的,而嘌呤糖苷酸键既可成顺式的也可成反式的。

嘧啶的糖苷键不能采取顺式构象,是因为嘧啶的第2位酮基不允许顺式糖苷键的存在,否则距离太近,不符合立体化学原理。

 

在Z-DNA中嘌呤碱是顺式的。因此在Z-DNA中嘧啶的糖苷链离开小沟向外挑出,而嘌呤上的糖苷键则弯向小沟。嘌呤与嘧啶的交替排列就使得糖苷键也是顺式与反式交替排列,从而使Z-DNA主链P-G-P行经与转轴平行,而P-C-P的行经与主轴垂直而呈锯齿状或“Z”字形。

 

左旋。因G的糖苷键呈顺式(syn),不仅使旋转方向发生改变。而且使G残基位于分子表面。

分子外形呈波形。这是由于碱基对向螺旋的外表面前移,中轴不再像B-DNA位于碱基对,而移向小沟。

虽然Z- DHA左手双螺旋-周有12个碱基对,但形式上只有6个重复单位,每个重复单位是两个碱基对。

 

Z-DNA与B-DNA连接处的结构,韩国人发表在2005年10月20日《nature》上。

 

 

②Z-DNA存在的条件

DNA分子中存在有Z-DNA区。而且有一些因素可以促使B-DNA转变为Z-DNA。

在高盐的条件下:NaCl的浓度超过2mol/L,MgCl2的浓度要超过0.7mol/L。

嘌呤-嘧啶相间排列:poly d(GC)n。在一定的条件下poly d(AC)n 甚至d(AT)n 以及更为复杂的排列如CGCATGCG也可形成Z-DNA。现在认为在适当的离子存在条件下,任何不少于6个bp的嘌呤-嘧啶交替排列顺序都能形成Z-DNA。

 

在活细胞中如果胞嘧啶被甲基化的(m5C)则无需嘌呤-嘧啶相间排列,在生理盐水的浓度下就可产生Z型。

如:m5C     GAT    G

             Gm5CTAm5C

1981年Behe发现这是由于甲基伸向大沟含水的环境中,周围局部形成疏水区,这一区域扩伸到B-DNA的大沟中,使B-DNA不稳定而转变为Z-DNA。这种m5C现象在真核生物中是常见的。

 

用Z-DNA抗体实验表明果蝇的X染体中就存在Z-DNA。

Z-DNA具有很强的免疫原性而B-DNA没有,若将1/3以上的鸟嘌呤的C8溴化,则能使Poly d (G-C)稳定于Z构象。因为用较大的溴原子取代了C8上的氢原子,稳定了鸟嘌呤糖苷键的顺式构象。将溴化的Poly d(G-C)用来免疫兔子或小鼠即可产生高浓度的Z-DNA抗体。

 

在体内有多胺化合物的存在,如精胺、亚胺和亚精胺,它们和阳离子一样,可和磷酸基团结合,减少负电荷的排斥作用,使B-DNA转变成Z-DNA。

某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电荷,与DNA结合可使DNA周围形成局部的高盐浓度微环境,这也是在活细胞中形成Z-DNA的原因之一。

 

在体内负超螺旋的存在也是Z-DNA形成的条件之一。抗体结合实验表明,将poly d(G-C)插入到质粒中,当质粒处于松弛状态时不能和Z-DNA抗体结合。

因此在生物B-DNA中某些区段具有Z-DNA构象是可能的。DNA是一个构象可变的动态分子。

 

③Z-DNA的生物学意义

Z-DNA的形成通常在热力学上是不利的。因为Z-DNA中带负电荷的磷酸根距离太近了,这会产物静电排斥。但DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。DNA解螺旋却是DNA复制和转录等过程中必要的环节,因此认为这一结构位点与基因调节有关。      

可能提供某些调节蛋白的识别。啮齿类动物病毒的复制起始部位有d(GC)有交替顺序的存在。

 

在SV40的增强子中有3段8bp的Z-DNA存在,若将其中2个Z-DNA片段除去,再接到b-珠蛋白基因上表达,则增强子失去活性。当将野生型SV40的Z-DNA中“T”和“C”转换成“C”、“T”时,不影响突变体的活性,但嘧啶转换成嘌呤时,由于破坏了嘌呤-嘧啶的相间排列,而使Z-DNA难以形成而SV40也失活。

 

另一个例子是原生动物纤毛虫,它有大、小两个核,大核有转录活性,小核和繁殖有关。大、小两核的DNA序列相同,而以荧光标记的Z-DNA抗体显示仅和大核DNA结合,而不和小核的DNA结合,说明大核DNA有Z-DNA的存在,可能和转录有关。

 

DNA螺旋上沟的特征在信息表达中的作用:

调控蛋白通过特定的氨基酸侧链与DNA双螺旋沟中碱基的氢原子供体或受体形成氢键,从而识别DNA上的遗传信息。

沟的宽窄和深浅直接影响到调控蛋白质对DNA信息的识别。

 

Z-DNA中大沟消失,小沟狭而深,使调控蛋白识别方式也发生变化。Z-DNA中出现的嘌呤-啶嘧交替排列,是在进化中对DNA序列与结构不断调整与筛选的结果,可能有其内在而深刻的含意。

 

DNA构象的可变性,即DNA二级结构的多态性的发现拓宽了人们的视野。

生物体中最为稳定的遗传物质也可以采用不同的姿态来实现其丰富多采的生物的奥妙。

 

利用X-射线衍射技术时的样品分析条件与被测DNA分子的天然状态相差甚远。因此,在反映DNA结构真实性方面这种方法存在着缺陷。

1989年,应用扫描隧道显微镜(STM)研究DNA结构克服了X-射线衍射技术的缺陷(分辨率1´10-10m) 。

 

STM可将被测物放大500万倍,且能直接观测接近天然条件下单个DNA分子的结构细节。它所取得的DNA结构资料更具有“权威性”。

STM证实了d(CG)重复序列的寡核苷酸片段为Z-DNA结构的事实。

STM技术的应用是DNA结构研究中的重要进展。

 

B-DNA结构参数

*7个螺旋周期的DNA得以量度,表中值+-标准差。

**间距指DNA双螺旋的高脊之间的距离,在含义上与宽度和深度有所不同。

 

RNA-RNA双链和RNA-DNA杂交分子一般采取A构象而不是B构象,原因在于RNA的核糖2-OH的存在使之不能适应B构象,否则它将与相邻的磷酸、核糖和碱基上的若干原子靠得太近而造成不稳定状态。

 

2.2.2.3 DNA构象家族

A-DNA、B-DNA和Z-DNA都不是只代表单一的构象,而是代表了一组相关的构象。这样一组相关的构象可以称为构象家族(conformational family )。

随着DNA分析技术由DNA纤维的x光衍射发展到单晶DNA的x光衍射,能够探知DNA构象的局部变化。用DNA纤维进行x光衍射得出的数据只能代表一组构象的平均值。

 

用DNA单晶进行x光衍射,得出的构象家族的平均值也差不多,但这些数值的变化范围却很大,例如每个碱基对的螺旋扭角对于B-DNA为28°~42°,对于A-DNA为16°~44°,这样的变化范围其原因在于一个碱基对中两个碱基的螺旋桨扭转效应(Propeller twist),而在对DNA纤维进行X光衍射的研究中基本上忽视了螺旋桨效应。

 

螺旋桨扭转是一个碱基对中的两个碱基并不处于同一平面中,而是两个碱基平面相对碱基的长轴各自向着相反的方向扭转。若沿着碱基对的长轴观察,靠近的一个碱基总是顺时针方向扭转。

这样,螺旋桨扭角也总是定义为正值。A-DNA为l5°,B-DNA为 12°,个别情况下可以低至3°,高至25°。

 

Structural Variation Defined by Bases

 

螺旋桨扭转效应的后果一方面改善了同一条主链中相邻碱基之间的堆集作用,使相邻碱基之间的重叠面积增大;另一方面又导致了相邻碱基对中但位于两条主链上的嘌呤环的过份接近,产生了构象上的不稳定状态。

由于嘌呤环是双环,它的长度接近或超过螺旋轴心,而每个碱基对的螺旋浆扭转又均为正值,这必然引起两条链上位于相邻碱基对中的嘌呤环之间的挤压。

 

 

随着DNA的碱基序列不同,嘌呤环的挤压状况也不同。当相邻二核苷酸对为嘌呤-嘧啶顺序时,挤压发生在大沟一側;当相邻二核苷酸对为嘧啶-嘌呤顺序时,挤压发生在小沟一側,且小沟挤压状况更为严重。

当然可以通过压缩相邻二核苷酸对中一个碱基对或两个碱基对的螺旋桨扭转来解决这种构型上的危机。但在实际的空间构象采取其他两种方式则更容易些。

 

方式一:增加挤压部位的碱基对平面转角(简称碱基转角,base roll angle)。尽管碱基对的两个碱基平面之间有螺旋浆扭转,但把碱基对看成一个整体,通过碱基对的长轴取两个碱基平面之间的平均平面作为碱基对的平面。两个相邻碱基对平面之间的夹角就称为碱基转角。

 

如果这一夹角张开于小沟方向,碱基转角定义为正值,如果这一夹角张开于大沟方向,则碱基转角定义为负值。

 

当发生大沟挤压时,则碱基转角向着大沟张开,其负值增加。当发生小沟挤压时,则碱基转角向着小沟张开,其正值增加,而且其增加的数值大约是大沟挤压时负值增加的两倍。

 

 

 

方法二:是减少螺旋扭角(helieal twist angle)。不管是大沟挤压还是小沟挤压结果都降低螺旋扭角,只是小沟挤压引起螺旋扭角降低的数值是大沟挤压的两倍。根据Calladine的计算方法,可以比较精确地预测两种右手双螺旋结构的碱基转角,螺旋扭角及螺旋桨扭角本身这些重要的螺旋参数。这些参数的预测值和实际测量值相当吻合。

 

2.2.2.4 三链DNA(H-DNA)

含(TC)n和(AG)n这样的同型嘧啶和同型嘌呤,并形成镜像重复或回文结构的序列,在低pH值条件下,双链DNA拆开后产生的多聚嘧啶链回折,并嵌入剩下的双链DNA大沟中形成分子内的三链DNA(hinged DNA, H-DNA)。

 

 

 

三链DNA中,位于大沟中的多聚嘌呤链与双链DNA中的多聚嘌呤链成平行走向,碱基按照Hoogsteen方式配对形成TAT,CGC三联体。

作用:与基因表达有关,第三股链可能阻碍一些调控蛋白或RNA聚合酶与DNA结合;干扰转录延伸;反义DNA。

 

鸟苷酸四聚体

 

四螺旋结构存在于端粒中,DNA分子或染色体分子可能彼此连接形成局部的四螺旋结构,可能起着稳定染色体和在复制过程中保持其完整性的作用。

 

2.2.2.5 影响多态性的因素

产生多态性的原因是由于多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键,从而使糖环可采取不同的折叠形式和苷键采取不同构象。

 

湿度和盐离子的影响:在溶液或细胞中的天然DNA大多数为B-DNA,但改变湿度或由钠盐变为钾盐、铯盐等,则会引起构象的变化,形成A-DNA、C-DNA等构象。

有机溶剂的影响:用乙醇沉淀DNA时可将DNA由B-DNA经C-DNA转变为A-DNA。

 

盐浓度的影响:高浓度盐溶液(4mol/L)会使B-DNA部分变构为Z-DNA。

碱基序列的影响: 人工合成的CGCGCG序列的高盐溶液中为Z-DNA构象;含(TC)n和(AG)n的同型嘧啶和同型嘌呤,并形成镜像重复的序列,在低pH值条件下,可形成分子内的三链DNA(H-DNA)。

 

在双螺旋结构中的碱基对中,由于Pu是双环结构大于Py的单环,因此在碱基对中会伸过中点突出到对方一侧,增加了碱基的堆积程度,也使官能团发生挤压,这种挤压随碱基序列发生变化。

双螺旋结构通过局部调整来缓解这种效应,这些变化使DNA形成了精细的结构,它正是DNA发挥功能时相应蛋白因子与靶位点作专一性识别和结合的标志。

 

2.2.3 核酸的变性和复性

变性和复性是双链核酸分子的重要物理特性。双链DNA、RNA双链区、DNA与RNA杂种双链(hybrid duplex)以及其它异源双链核酸分子(hetero duplex) 都具有此性质。

 

2.2.3.1 DNA的变性(denaturation)

变性是DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。即维持双螺旋稳定性的氢键和疏水键的断裂。变性不涉及到其一级结构的改变。

 

破坏双螺旋稳定性的因素都可使DNA变性

DNA分子中的碱基处于配对和不配对的动态平衡状态,很多因素会引起它向不配对方向转变,即引起DNA变性。

测量变性的方法有分光光度法、流体力学法、量热法、极谱法、旋光色散法、圆二色性法和层析法等。使用最广泛的方法是紫外光吸收法(260nm)。

 

加热:高温(>70℃)可破坏碱基间的氢键。然而高温可能引起磷酸二酯键的断裂。

 

离子强度:提高溶液的离子强度,可中和DNA分子链上磷酸基团的负电荷,降低它们之间的排斥力,稳定DNA的结构。

 

极端的pH值:pH﹤1时,DNA的磷酸二酯键会被水解;pH﹥11.3时,DNA的所有氢键断裂变成单链的变性DNA。在制备单链DNA时,优先采取碱变性。

要维持单链状态,或者保持pH大于11.3,或者盐浓度低于0.01mo1/L。 在这样低盐浓度时,由于磷酸基的静电斥力,可以配对的碱基无法相互靠近,碱基堆集作用也仍然保持在最低水平。

 

疏水作用:甲醇可增加碱基的溶解度,三氟醋酸钠可降低DNA分子的疏水作用,破坏双螺旋结构引起变性。

 

尿素及甲酰胺:它们可与碱基间形成氢键。

碱基堆积:氢键和碱基堆积是一致的,碱基堆积是一种协同作用,处于中间的碱基比两边的碱基稳定,线状双链DNA分子的两端常有7个未配对的碱基,因此少于15bp的双链DNA片段极不稳定。

 

变性导致DNA 一些理化及生物学性质改变

变性DNA溶液粘度降低:DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构,变性后变成“柔软” 而松散的无规则单股线性结构,DNA粘度因此而明显下降。

 

增色效应或高色效应

(hyperchromic effect)是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。

变性后DNA在260nm下的紫外吸收光密度的观测值通常较变性前有明显增加。

 

DNA分子对紫外光的吸收峰在260nm。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。

变性DNA的双链解开,碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收,故产生增色效应。

 

不同来源DNA的变化不一,如大肠杆菌DNA经热变性后,其260nm的光密度值可增加40%以上,其它不同来源的DNA溶液的增值范围多在20~30%之间。

 

热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度( melting temperature,简写Tm)。

热变性是在很狭的温度范围内突发的跃变过程, 很像结晶达到熔点时的熔化现象,故名熔解温度。

 

以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图,得到的典型DNA变性曲线呈S型。

 

S型曲线下方平坦段,表示DNA的氢键未被破坏,待加热到某一温度处时,次级键突发断开,DNA迅速解链,同时伴随吸光率急剧上升,此后因“无链可解”而出现温度效应丧失的上方平坦段。

Tm是被测DNA的50%发生变性(增色效应达到一半)时的温度。

 

DNA本身性质决定了Tm

(1)DNA的均一性

变性的DNA链各部分的氢键断裂所需能量较接近,Tm值范围较窄,反之亦然。

样品DNA的组成是否均一:如样品中只含一种病毒DNA,Tm值范围较窄,若混杂其它DNA,则Tm值范围较宽。原因也与DNA的碱基组成有关。

 

DNA分子中碱基组成的均一性:如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段,比天然DNA的Tm值范围窄。因它在变性时的氢链断裂几乎可“齐同”进行,故要求的变性温度更趋于一致。

 

(2)DNA的(G+C)含量

不同生物中(G+C)含量可从20%~80%。

Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,Tm值越高。

 

G-C碱基对有3对氢键,A-T碱基对有2对氢键,DNA中(G+C)含量高能增强结构的稳定性,破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量,故(G+C)含量高的DNA,其变性Tm也高。

 

一定离子强度下(DNA溶于0.2mol/L NaCl): Tm与(G+C)含量(X) 的关系可用经验公式表示:

 X%(G+C)=2.44(Tm-69.3)

 

l噬菌体DNA含有超过48.5 Kbp,在高pH条件下富含 A+T区域开始变性。

 

2.2.3.2 DNA的复性(renaturation)

变性DNA 在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的过程。

已经变性的DNA需要下列条件才能复性:

①有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力,常用的盐浓度为0.15至0.50mo1/L的NaCl。

②有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键,但温度太高,又会使配对碱基之间的氢键又难以形成的。

 

复性机制:复性首先从单链分子的无规则随机碰撞运动开始,这与DNA浓度、溶液温度和离子强度有关。有时两条单链之间非对应的某一小段碱基之间也能形成氢键,但这样会使链上的大部分碱基都不能互补,所形成的氢键都是短命的,很快会被分子的热运动所瓦解。只有当应该配对的一部分碱基(10~20bp)相互靠近时,特别是富含G-C的序列先形成氢键而产生一个或几个双螺旋核心(成核作用,nucleation ),然后两条单链的其余部分就会像拉链一样迅速形成双螺旋结构。

 

完全变性DNA一般需要几个小时才能复性。复性DNA分子不一定是原有的一对互补链,大部分复性DNA分子都不是原 配的。

热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为" 退火"(annealing)。 " 退火"也用以描述杂交核酸分子的形成。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。

 

温度和时间:变性DNA溶液在比Tm低25℃的温度下维持一段长时间,其吸光率会逐渐降低。将此DNA再加热,其变性曲线特征可以基本恢复到第一次变性曲线的图形。这表明复性是相当理想的。

一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件,越远离此温度,复性速度就越慢。

 

在很低的温度(如4℃以下)下,分子的热运动显著减弱互补链结合的机会自然大大减少。维持在Tm以下较高温度,更有利于复性。

复性时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下),复性几乎是及不可能的,核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。

降温时间太短以及温差大均不利于复性。

 

DNA浓度:复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。这一过程进行的速度与DNA浓度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多,相互碰撞结合“成核”的机会越大。

 

 

DNA顺序的复杂性:简单顺序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(T)这二种单链序列复性时,互补碱基的配对较易实现。

顺序复杂的DNA,如小牛DNA的非重复部分,一般以单拷贝存在于基因组中,这种复杂特定序列要实现互补,显然要比简单序列困难得多。

 

复性过程可用二级反应动力学公式来处理:

    S+S’=D

S、S’:单链互补DNA;

D:双链DNA。

根据二级反应动力学公式:

 

积分后得:

 

C:t时间的单链浓度;

k:速度常数;

t:时间;

Co:单链DNA初始浓度。

 

在一个指定实验中,Co是已知的,C可测定,

 

当有一半单链DNA复性时,即

 

代入下式

 

则:

 

在复性实验中,若将初始浓度、温度、离子强度、片段大小都确定后,则唯一可变的因素就是顺序的复杂性。实验表明,速度常数k与DNA的复杂性N成反比:K=1/N

复杂性N:最长的没有重复序列的核苷酸对的数值,例如(ATATAT…),其N值为2,(ATGC)的N值为4,没有重复序列的含有10核苷酸对的DNA分子的N值为105

Cot1/2的大小代表了基因组的大小和DNA顺序的复杂程度。

 

原核生物基因组为非重复顺序,故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接与基因组大小成正比,对于真核生物基因组中的非重复片段也是如此。

在核酸复性研究过程中,确定一定的温度、离子强度、核酸片段大小等条件下,以C/Co 对Cot作图,可以得到Cot曲线。

 

polyU+polyA,N=1,复性最快;牛的非重复DNA序列是复性较慢。

 

在标准条件下(0.18ml/L阳离子浓度,400核苷酸的长的片段)测得的复性率达0.5时的Cot值称Cotl/2,它与核苷酸对的复杂性成正比。

对于原核生物核酸分子, Cotl/2可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度。

真核基因组中因含有许多不同程度的重复序列(repetitive sequence),所得到的Cot曲线很复杂。

 

DNA杂 交(在第八章讲授)

复性DNA中,如果两条链来源不同,就叫做杂交分子。DNA杂交技术可以用来检验DNA的缺失、插入,还可以用来考察不同生物种类在DNA分子中的共同序列和不同的序列以确定它们在进化中的关系。

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