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3.2 原核生物DNA的复制
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:10890    更新时间:2011/4/15
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3.2.1 DNA的复制酶和相关蛋白

DNA复制实际上就是DNA指导的DNA合成代谢,需要有DNA作为复制的模板。

体外复制实验证明,新合成DNA的特异性完全取决于事先加入的模板DNA。三磷酸核苷酸(dNTP)是合成原料。

细胞内还有许多酶和蛋白质参与DNA的复制。

 

3.2.1.1 解旋酶(Helicase)

DNA复制时,解旋酶在ATP的作用下可促使DNA母链不断解开形成单链。

 

大肠杆菌中的解旋酶DnaB作为引发体的成员,参与复制叉的形成,并结合于一个复制叉,利用ATP水解的能量解开双螺旋,推动复制叉向前延伸。

 

3.2.1.2 单链DNA结合蛋白(SSB)

解旋酶沿复制叉方向推进产生了一段单链区,细胞内大量的单链DNA结合蛋白(single strand DNA binding protein SSB)能和单链DNA结合,防止其重新配对形成双链DNA。

 

单链结合蛋白通过与磷酸骨架结合使DNA单链相互分开,它们离开暴露的碱基,所以那些碱基可以作为DNA合成的模板。SSB与解旋酶不同,它不具备酶的活性。在大肠杆菌细胞中主要SSB是177肽所组成的四聚体,可以和单链DNA上相邻的32个核苷酸结合。

 

SSB的作用:使DNA单链保持一种伸展构象,作为模板;使解开的单链不形成发卡结构;保护DNA单链不受Dnase水解。

SSB结合DNA单链有协同性(cooperative binding):一个SSB四聚体结合于单链DNA上可以促进其他SSB四聚体现相邻的单链DNA结合。

 

SSB可以重复使用,当新生的DNA链合成到某一位置时,该处的SSB便会脱落,并被重复利用。

 

3.2.1.3 DNA拓扑异构酶
(DNA Topisomerase)

拓扑异构体(topoisomer):具有不同螺旋数的同一DNA分子两种异构体。

拓扑异构酶:可使DNA的两种拓扑异构体互变的酶。

DNA在细胞内以超螺旋状态存在,DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。

 

拓扑异构酶的功能:与DNA形成共价结合中间体,使DNA磷酸二酯键断裂,形成DNA nick,DNA的一条链进行解旋,旋转而改变DNA分子的拓扑状态。

 

拓扑异构酶可使DNA发生连环化(catenate)、脱连环化(decatenate)、打结(knot)和解结(unknot)。

 

TopoⅠ Reactions

 

Topo Ⅱ Reactions

 

拓扑异构酶参与DNA的复制、转录的重组等过程。

 

拓扑异构酶的种类分为Ⅰ型和Ⅱ型。

原核拓扑构酶Ⅰ:MW=100kD,单肽链,含3~4个Zn。

作用是暂时切断一条DNA链,形成酶-DNA共价中间物而使超螺旋DNA松弛,然后再将切断的单链DNA连接起来。每次改变一个连环数。

 

原核拓扑构酶Ⅰ作用机制:

①酶与DNA结合使双链解旋;②使一条链切开,但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转;③酶使另一条链经过缺口,然后再将两断端连接起来;④酶从DNA上脱落,两条链复原,得到的DNA比原来少一个负超螺旋。

 

 

 

拓扑异构酶Ⅱ

拓扑异构酶Ⅱ也称旋转酶。广泛存在于各种生物中。使正超螺旋转化为负超螺旋,每次改变两个连接数。

 

大肠杆菌中的DNA旋转酶(DNA gyrase),能将负超螺旋引入DNA分子,在ATP供能时酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA。

 

几乎所有天然状态的双链DNA均以负超螺旋的方式存在,特别是进行半保留复制的DNA均以种种拓扑异构体的形式存在。

负超螺旋是DNA复制的必需条件,负超螺旋可使DNA双链碱基对打开所需要的能量降低4.1KJ/mol,因而,有利于DNA的双链分开。

 

真核生物拓扑异构酶

酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的Ⅰ拓扑异构酶的特性相似,但与原核的酶有明显差异。

Ⅰ型:MW=95kD,单体蛋白,不需ATP。

Ⅱ型:MW=150~180kD,均为二聚体,需ATP和Mg2+

 

3.2.1.4 引物酶(Primase)

引物酶以单链DNA为模板,利用核糖核苷酸合成RNA(6~10nt)作为DNA合成的引物。

 

引物的意义在于减少致死突变。DNA合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物RNA随后被降解,从而减少了复制错误。

 

DNA合成以RNA为引物的实验证据

Reiji 以α–32P–dNTP标记+未标记NTP为底物。引发合成后,用稀碱处理。

 

32P出现在水解产物中(RNA水解),证明RNA为引物。

 

引物酶催化引物RNA分子的合成,但它不同于RNA聚合酶。引物酶对雷米封不敏感,而RNA聚合酶则敏感;引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制,而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA从而将遗传信息由DNA传递到RNA。

 

大肠杆菌的引物酶由一条多肽链组成,MW为60KD,每个细胞中有50~100个分子,由大肠杆菌的dnaG基因编码。

但在单链噬菌体M13 DNA和质粒Co1E1 DNA复制时,引物的合成是由RNA聚合酶催化的。

噬菌体T7的Gene4蛋白,T4的Gene41和61蛋白等也具有引物酶的活性和具有大肠杆菌引物酶相似的功能。

 

3.2.1.5 DNA聚合酶(DNA Polymerase)

DNA聚合酶的性质

①以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;

②需要模板和引物的存在;

③不能起始合成新的DNA链;

④催化dNTP加到生长中DNA链的3’-OH末端;

⑤催化DNA合成的方向是5’→3’。

 

原核DNA聚合酶:DNA polymerase Ⅰ、DNA polymerase Ⅱ和DNA polymerase Ⅲ

 

DNA pol的发现

1956年,Kornberg用无细胞E.coli系统证明DNA是模板合成。

1957年发现DNApolⅠ。

 

①大肠杆菌DNA polymerase Ⅰ

1956年Kornberg发现DNA聚合酶,又称Kornberg酶。

此酶已经研究清楚且代表了其他DNA聚合酶的基本特点。

 

酶的性质

DNA polⅠ由一条多肽链组成,约含1000个氨基酸残基,MW为109KD。分子含有一个二硫键和一个SH基。每个分子中含有一个Zn2+,在DNA聚合反应起着很重要的作用。

每个大肠杆菌细胞中含有约400个分子,每个分子37℃下能催化667nt/min掺入正在生长的DNA链。

 

DNA polⅠ可被枯草杆菌蛋白酶裂解成2个片段,大片段MW为76KD,称为Klenow片段,具聚合酶和3’→5’外切酶的活性,由两个结构域组成。

小片段的MW为34KD,具有5’→3’外切酶活性。

 

Some DNA polymerases have a common structure.

 

DNA PolⅠ在空间结构上近似球体,直径约65Å,在酶的纵轴上有一个约20Å的深沟(cleft),带有正电荷,是酶的活性中心位置。

 

酶的活性中心位置上至少有6个结合位点:

a. 模板DNA结合位点;

b. DNA生长链或引物结合位点;

c. 引物末端结合位点;

d. 脱氧核苷三磷酸结合位点;

e. 5’→3’外切酶活性位点,用以结合生长链前方的5’-端脱氧核苷酸并切除之;

f. 3’→5’外切酶活性位点,用以结合和切除生长链上未配对的3’-端核苷酸。

 

酶的功能

a. 聚合作用

在引物的3’-OH末端,以dNTP为底物,按模板DNA上的指令由DNA polⅠ逐个聚合上核苷酸。

酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后,可能使酶的构象发生变化,促进3’-OH与5’-PO4结合生成磷酸二酯键。

 

b. 3’→5’外切酶活性(校对作用)

3’→5’外切酶活性是从3’→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。错误核苷酸进入polⅠ的结合位点不能与模板配对,无法改变酶的构象而被3’→5’外切酶活性位点所识别并切除。

 

在T4噬菌体突变株中分离得到的T4 DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性很低,使DNA复制的真实性降低,而易发生突变。

具有抗突变能力的T4突变株中的DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性比野生型高得多,因此,其DNA复制真实性好,变异率低。

3’→5’外切酶活性的主要功能是校对作用。维持了DNA复制真实性。

 

c. 5’→3’外切酶活性(切除修复作用):

5’→3’外切酶活性是从5’→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链。它只作用具切口的双螺旋DNA,并在切口以外的配对区切割。

 

5’→3’外切酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5’-末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性(每次能切除10nt)。

DNApolⅠ聚合酶活性和5’→3’外切酶活性协同作用

双链DNA上的单链切口可激活DNA polⅠ的5’→3’外切酶活力,从切口的5’-端切除旧链,同时从切口开始合成新链,可使DNA链上切口向前推进,产生缺口平移(nick translation),即没有新DNA合成,只有核苷酸交换。

 

缺口平移可从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。

如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP,则重新合成的新链为带有同位素标记的DNA分子,可以用作探针进行分子杂交实验。

 

DNA polⅠ不是大肠杆菌中DNA复制的主要酶。

a. 体内DNA合成速率比纯化的DNA polⅠ催化dNTP掺入速率(667nt/min)高20倍;

b. 大肠杆菌的一个突变株中,polⅠ的活力正常,但染色体DNA复制不正常;

c. 在一些突变株中,polⅠ的活力只是野生型的1%,但DNA复制却正常,而此突变株对辐射和化学诱变剂却高度敏感。

DNA polⅠ在DNA修复中起着重要的作用。

 

②大肠杆菌DNA pol Ⅱ

1970年发现DNA polⅡ。MW为120KD,每个细胞内约有100个酶分子,但活性只有DNA polⅠ的5%。

聚合作用:polⅡ催化DNA的聚合,它最适模板是双链DNA而中间有小空隙(gap,50~200nt)的单链DNA部份。

 

polⅡ具有3’→5’外切酶活性,但无5’→3’外切酶活性。

polⅡ缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制正常。表明polⅡ不是DNA复制的主要酶,它可能在DNA损伤修复中起一定作用。

 

③大肠杆菌DNA polⅢ

DNApol Ⅲ的发现

DNApolⅠ的合成DNA,参入nt的速率为600nt/min,但实际测定数约12000nt/min,比DNA pol Ⅰ的催化速率大20倍。

遗传分析表明,DNA复制涉及多种基因,但DNA polⅠ是单肽链。

 

1969年,Cairns发现E.coli的一种突变体的细胞抽提液,虽然反应显示﹤1%的DNA polⅠ活力,但该突变体能以正常速率繁殖。突变体对紫外辐射和化学诱变十分敏感,表明可能存在另一种DNA pol。

 

DNA pol Ⅲ至少以10种亚基组成复合物(DNA聚合酶全酶)参与DNA复制。

、及亚基构成核心聚合酶(core polymerase)。

具有聚合酶活性;有3’→5’核酸外切酶的活力。

b构成聚合酶的卡箍(clamp),结合在DNA模板链上。

 

DNA聚合酶Ⅲ的主要亚基及其装配层次组成

亚基     MW(×103)           组装层次

  a            130

 ε            27.5  

 θ            10  

 τ            71  

 γ            47.5

 δ            35

 δ           33

Χ              15

Φ              12

β             40.6

层次                   持续性                    刺激因子

pol Ⅲ                     10                             无

pol Ⅲ                    60                         亚精胺

pol Ⅲ*                  200                           SSB

全酶                     ﹥105                        SSB

 

pol Ⅲ全酶的结构是一种非对称二聚体。

pol Ⅲ在细胞内数量少(每个大肠杆菌细胞中只有10~20个酶分子),但催化dNTP掺入DNA链的速率是DNA polⅠ的15倍。

polⅢ具有聚合酶和3’→5’外切酶活性。

 

DNA pol Ⅲ是细胞内DNA复制所必需的酶,缺乏该酶的温度突变株在限制温度(non permissive temperature)内是不能生长的,此种突变株的裂解液也不能合DNA,但加入pol Ⅲ则可以恢复其合成DNA的能力。

3.2.1.6 DNA连接酶(DNA ligase)

DNA在随后链上的复制是不连续的,合成的DNA片段需要连接酶连接。

DNA连接酶的主要功能是借助ATP或NAD水解提供的能量,催化双链DNA上的单链断点的5’-端与3’-端生成磷酸二酯键,封闭DNA双链上的断点。

 

DNA连接酶的作用条件

①被连接的两链必须与另一链(模板链)互补;

②两链相邻;

③每次只能连接一个切口;

④使一条链的5’-P与另一链的3’-OH形成磷酸二酯键。

⑤连接能量来自NAD(如E.coli或T4诱导的连接酶,动、植物中的酶)。

⑥缺口缺失核苷酸不连接。

连接酶作用机制

①NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的1个Lys残基的ε-NH2上。

②酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基转移到DNA的5’-磷酸基端。

③被激活的5’-磷酰基端和DNA的3’-OH端生成磷酸二酯键。

DNA连接酶催化的连接反应是可逆的。逆反应过程可在AMP存在时,使共价闭环超螺旋DNA产生有缺口的DNA-腺苷酸,生成松弛的闭环DNA。

大肠杆菌的DNA连接酶(MW 75KD)被胰蛋白酶水解形成的小片段仍具有部份活性,可以催化酶与NAD(不是ATP)反应形成酶-AMP中间物,但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。

 

大肠杆菌细胞中约有300个分子的DNA连接酶。与DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近。

连接酶在DNA复制、修复和重组中起重要作用,连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

 

在真核生物细胞中的DNA连接酶,分为连接酶Ⅰ和Ⅱ,反应中利用ATP所提供的能量。

DNA连接酶Ⅰ分子量约为200KD,主要存在于生长旺盛细胞中,

DNA连接Ⅱ分子量约85KD,主要存在于生长于不活跃的细胞中(resting cell)。

 

在DNA复制过程中还有许多蛋白质参与,如大肠杆菌细胞中就有三十多种蛋白质参与DNA复制,许多蛋白质的功能目前尚不明了。

DNA复制过程中还有许多未知的因子参与,DNA复制过程中许多具体的细节尚不十分清楚。

 

T4Ligase特性

①可连接DNA与DNA,也可连接RNA与RNA。

②可连接DNA中的单链切口,也可连接粘性末端切口和平齐末端切口。

T4Ligase可作为重组工具酶。

3.2.2 原核生物DNA复制的引发

尽管原核生物是较简单的单细胞生物体,但其复制过程很复杂,并且是一个顺序性过程,涉及到多种酶和蛋白因子,是这些酶和蛋白因子协同作用的结果。

 

对E.coli DNA复制机制的认识是利用E.coli突变体和φx174的复制进行初步研究的结果。

研究方法:①获得突变体,对突变基因研究获得其功能;②反义RNA基因工程;③点突变基因工程。

大肠杆菌复制基因

 

利用噬菌体研究原核DNA复制

噬菌体DNA有线型、环型、单链、双链,其复制机制可表明各种形式的DNA复制模式;噬菌体利用寄主的基因产物进行复制,复制行为与寄主相似。

 

3.2.2.1 M13噬菌体复制的引发

M13基因组为6407nt的单链环状DNA分子,在5480~5820nt间有5个发夹结构,其中第3个最重要,有59个nt,此双链区是一个复制起始的信号。

 

M13利用宿主细胞的RNA pol在发夹结构前6nt开始合成引物RNA。对于RNA pol如何识别这个发夹结构作为起始位点的还不清楚,可能还涉及其他一些蛋白质。

当RNA链合成到20~30nt时形成的RNA-DNA杂交体使发夹结构破坏,将另一半发夹结构释放出来。因此,SSB就结合到这段序列上。

 

DNA pol III以RNA为引物合成DNA链直到RNA引物的开始处。引物被DNA pol I切除并补齐因RNA切除后形成的空缺,切口再由连接酶连接起来。

G4噬菌体(5577nt)的复制与M13的不同之处在于它不是由RNA聚合酶起始复制,而是由引物酶直接结合到不能结合SSB蛋白的发夹结构上,引物酶合成一段26~29nt,互补于发夹结构一条链的RNA。DNA链在RNA 3’-OH上延长,此后的反应和M13是相同的。

因此,M13的复制能被RNA聚合酶的抑制剂——利福平所抑制,而G4和φX174的复制则不被利福平所抑制。

 

泳道1:引物合成时不加dNTP;2:引物合成后加入dNTP;3:起始反应时加入dNTP和NTP

3.2.2.2 φx174的复制

φX174的复制比M13和G4复杂,需要更多的蛋白质因子参与,形成一个类似大肠杆菌中的复制引发体,并且可能在几个位点起始DNA的合成,可作为冈崎片段合成起始的范例。

 

φx174的复制模式

Φx174的DNA复制除模板外,复制系统均由寄主提供。

Φx174(+)链(SS)®合成φx174(-)链,形成RF φx174(SS→RF)®RF繁殖(RF→RF)®新的φx174(+)链产生(RF→SS)

 

fX174的(-)链合成(SS→RF)

①fxl74的(+)链进入寄主细胞,除分子中的发夹结构外,其它部分被SSB覆盖。(-)链合成(SS→RF)需引物体(primosome)参与。

 

在基因F和G间的70nt片段是引物体组装位点(primosome assembly site,pas),pas形成44nt组成的发夹结构可被PriA识别,在PriB和PriC参与下形成复合物。

 

②由PriA、PriB和PriC组成的复合物与DnaT、DnaB和DnaC组装成预引物体(preprimosome)。其中DnaB和DnaC形成由ATP稳定化的B6C6复合物。预引物体与引物酶(DnaG)结合成引物体。

③引发体在pas位点上形成,但引物合成是在很多位点上,表明引发体可沿着单链DNA引发位点移动。当引物合成后,PriA水解ATP引起DnaB变构而降低与单链DNA的亲和性,移动到另一个起始位点,ADP又被ATP取代,引物酶能稳定DnaB·ATP·ssDNA复合物,开始另一个引发反应。

引发体至少含DnaB、PriA和引物酶。

PriA可识别pas位点,并且还具有水解ATP和置换SSB的活性,这对引发体移动到其它位点进行引发非常重要。M13和G4仅有一个引发点。

 

④DNAPolⅢ全酶从引物延伸合成DNA片段。引发体移动的方向同DNA链延长方向相反,这说明双链DNA复制时,随从链合成冈崎片段的情形。当复制叉向前移动时,在引发体前方就形成单链,每一次引发反应以后,引发体就沿着单链向前移动到下一个冈奇片段合成开始的位点。因此,引发物移动的方向同复制叉相同,同随从链DNA合成方向相反。

⑤PolⅠ切除RNA引物填补缺口,连接DNA片段。形成的双链DNA称为RF。

⑥引物体继续与DNA相结合以备参与(+)链的合成。

fxl74(-)链合成是不连续的。

 

fX174的(+)链合成(RF→SS)

(+)链合成涉及噬菌体编码的gpA和大肠杆菌的Rep。gpA(60kD)对(+)链原点具有专一性的核酸内切酶活力。gpA的功能是引发复制起始。

 

①gpA借引物体结合于识别位点,专一性切割4305和4306间的磷酸二酯键产生切口。gpA通过其酪氨酸残基与4306位5’端结合,保存链能。

②Rep蛋白结合于gpA处的(-)链。Rep蛋白从(+)链使gpA复合物从(+)链的5’端开始使双链DNA解链,分离出的(+)链被SSB保护。

 

③polⅢ全酶从(+)链3’端使DNA链不断延伸,形成环化的滚环结构(looped rolling structure)。而原来的(+)链在复制叉移动时仍与gpA相连,如同逐步被剥离。

 

④复制绕(-)链超过完整一周后产生1个双股复制原点,gpA在此再做专一切割,再与新形成的5’端共价结合,gpA的第2次切割产生单位长度的fX174 DNA,它的3’-OH向gpA5’-P做亲核攻击形成环状分子(+链)。

 

每个gpA分子含2个活性酪氨酸,故可完成相继地切割,并与5’-端相连。

 

在由fx174感染的中期,每个新合成的(+)链指导(-)链合成从而形成RF。在感染的后期,新合成的(+)链通过噬菌体编码的病毒成熟蛋白和衣壳蛋白(gpB、E、D、F、G和H)形成新的病毒粒子。

 

φx174(-)链合成为随后链复制模式。可用于研究E.coli随后链的合成机制,不连续合成。

φx174(+)链合成为主导链复制模式。可用于研究E.coli主导链的合成机制。连续合成。

 

大肠杆菌基因组是双股环形DNA,其复制是由单一原点(origin)开始的q式复制。

origin处形成复制叉,经过先导链的连续复制和滞后链的不连续复制,到达终点完成复制。

 

3.2.2.3 E.coli DNA复制的引发

E.coli的DNA复制起始指从origin(原点)开始的 起始过程,这一过程不同于随后链上冈崎片段的起始。

DNA复制的引发包括:起始识别→解链→解旋→引发体组装。

 

复制原点(origin)

DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始,而是从特定的区域开始。

大肠杆菌的复制起始点(oriC)位于其基因组天冬酰胺合成酶和ATP合成酶操纵子间,oriC包含245bp。

 

ori的特性

复制起点几乎都是富含A-T的序列;

已经分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC。由245bp的DNA片段组成。

 

oriC含有2个系列的重复单位,其中有3个13bp重复序列和4个9bp重复序列,均富含AT。

ori在所有细菌复制起始位点中都是保守的

oriC在不同原核生物中有同源性,很多细菌的ori区在结构上相似,在序列上有相当的保守性,且在分类关系上愈接近的细菌间其同源性愈高,表明DNA复制起点的重要性。

 

将一个复制起点连接到任一DNA上,都能支持其复制。

9bp(A位点)为DnaA蛋白识别位点。

引发体的形成

复制开始的是形成引发体,这需要很多蛋白因子的参与。

①DnaA蛋白识别起始序列并结合于oriC的9bp重复序列,形成oriC负超螺旋包裹在外,20~40个DnaA蛋白在内的复合物。

②HU蛋白参与并促进DnaA蛋白识别3个13bp串联重复序列使DNA熔链形成开放复合物。

用核酸酶P1(作用ssDNA)证明解链部分约为45bp。

 

③DnaB和DnaC(引发体成员)蛋白进入熔链区形成前引物复合体,DnaC可推动解旋酶DnaB与DNA的结合。

④SSB结合在被解开的单链上,由PriA、PriB、PriC、DnaT、DnaB和DnaC等6种蛋白质组成引发前体(preprimosome)。

 

⑤引发前体进一步与引物酶(DnaG,primase)组装成引发体(primosome)。

 

⑥在SSB和旋转酶(拓扑异构酶)的参与下,引发体可在单链DNA上移动,在DnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。引发体先在前导链上由引物酶催化合成RNA引物,此过程称为转录激活(transcriptional activation)。

 

⑦DNA polⅢ组装和复制叉上二聚体形成。

 

⑧引发体在滞后链上沿5’→3’方向相对移动,并在模板链上断断续续地引发生成滞后链的引物RNA,供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用。在RNA引物3端DNA开始聚合。

 

许多因子协同作用才使引发体在滞后链上移动,识别合适的引物合成位置,并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。

在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列,表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。

 

 

RNA引物形成后,DNA pol Ⅲ的亚基组装成非对称DNA聚合酶Ⅲ二聚体,它催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。

 

3.2.3 DNA链的延伸

3.2.3.1 正超螺旋的消除

螺旋酶在复制叉处边移动边解开双链,DNA聚合酶Ⅲ催化DNA新生链的合成。

DNA解链时必产生正超螺旋,当达到一定程度后就会造成复制叉难以继续前进而终止DNA复制。而细胞内DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。

 

解除正超螺旋的机制

①DNA在生物细胞中本身就是负超螺旋,当DNA解链而产生正超螺旋时,可以被原来存在的负超螺旋所中和。

②DNA拓扑异构酶Ⅰ可打开一条链,使正超螺旋状态转变成松弛状态;同时DNA拓扑异构酶Ⅱ(旋转酶)也可以在复制叉前方地将负超螺旋引入双链DNA。

 

3.2.3.2 复制体(replisome)的形成

DNA复制体是在复制叉附近,由DNA polⅢ二聚体、引发体和DnaB等构成的类似核糖体大小的复合体。

复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。

不同系统(噬菌体、E.coli、动物、植物病毒)中的复制体组分虽有差异,但功能相似。

 

复制体包括Ori的复制体(主导链和随从链的是否相同)和复制起始后延伸过程的复制体两种。

延伸过程的复制体为非对称的DNApol Ⅲ二聚体、DnaB、随从链上的SSB和引发体等组成。

 

3.2.3.3 DNA链的延伸

前导链和滞后链由同一pol Ⅲ二聚体延伸。

前导链的合成:由DnaG(primase)在复制起始位点附近合成1个10~60nt的RNA引物,然后由pol Ⅲ把dNTP加到该引物上。

 

滞后链的合成:产生Okazaki fragments,消除RNA引物并由DNA pol I补上一小段DNA序列,由DNA ligase把两个片段相连。

 

DNA滞后链与主导链合成的不同步。

在DNA复制叉处由一个非对称DNA polⅢ二聚体,同时分别进行复制DNA前导链和滞后链。

 

位于滞后连的引发体,在合成引物后DnaG可将模板链提起(或成环),使RNA引物3′端位于pol Ⅲ处,然后再折向与未解链的双链DNA在同一方向上,则滞后链的合成可以和前导链的合成在同一方向上进行。

 

pol Ⅲ的每一个催化中心合成一个子链。DnaB负责在复制叉上向前移动。引发体拖着一条DNA链通过。

 

DNA polⅢ沿着滞后链模板催化在RNA引物上聚合DNA链。滞后模板链被SSB结合,随冈崎片段延伸priA可利用ATP供能除去SSB。

当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时,滞后链模板及新合成的冈崎片段便从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。

 

复制叉不断迁移便又产生了一段滞后链模板,它重新环绕polⅢ,并合成冈崎片段。

因此,前导链合成不会超过滞后链太多。这样引发体在DNA链上和polⅢ同速移动。

 

当冈崎片段形成后,DNA polⅠ通过其5’→3’外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物;同时,利用后一个冈崎片段作为引物合成DNA。

 

最后的缺口由DNA ligase连接形成完整的滞后链。

 

DNA复制过程

3.2.4 DNA复制的终止

3.2.4.1 E.coli DNA复制的终点

在DNA上存在着复制终止位点,复制叉在此位点相遇(forks meet)。

E.coli的DNA复制终点序列(23bp):

AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT

TTAATCATACAACATTGATTTCA

 

终止序列可被Tus蛋白(tus基因编码)识别,并结合于其上,它只让一侧复制叉通过,并可能阻止DnaB的解链作用,使DNA复制在终止位点终止。

 

E.coli的两个复制叉在相距终点100kb时,复制速度减慢,从而协调2个复制叉到达的时间。

 

终止的调节:在终止点Forks meet两侧各有几个短序列,如:terE、D、A;terC、B。当一侧复制叉前进的快,而另一侧前进的慢时,快侧复制酶则会在ter位点停止,等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个“replication fork trap”

 

大肠杆菌DNA复制起始的调控与Dna A对甲基化位点的识别密切相关。

 

大肠杆菌在一个细胞周期中可能发动2次DNA复制。

 

3.2.4.2 DNA复制后的末端问题

DNA复制时,当RNA引物被切除后,中间所遗留的间隙由DNA聚合Ⅰ所填充。

而线性DNA分子以5’→3’为模板的滞后链的合成,末端的RNA引物被切除后是无法被DNA聚合酶所填充的。

 

①T7-DNA复制方式

T7-DNA两端的DNA序列区有160bp长的序列完全相同。

T7-DNA复制时,产生的两个子代DNA的3’-端尾巴以互补结合。再由DNA polⅠ填充和DNA连接酶连接后,形成2个单位长度的T7-DNA分子。

 

这样复制下去,便可形成多个单位长度的T7DNA分子。

这样的T7-DNA分子可被特异的内切酶切开,用DNA polⅠ填充,形成与亲代DNA完全一样的双链T7DNA分子。

 

②痘病毒DNA的复制

痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时,在线性分子中间的一个复制起点开始,双向进行,将发夹环状结构变成双链环状DNA。

在发夹中央将不同DNA链切开,使DNA分子变性,双链分开。在每个分子两端形成单链尾端,再以自我互补,形成完整的发夹结构,与亲代DNA分子一样。

 

腺病毒(Adenovirus) DNA复制

 

腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒,基因组长约36kb。

腺病毒的基因组以线性的双链DNA形式存在,由蛋白VII和一种mu的小蛋白紧密地环绕在其周围,起到类组蛋白样的作用。蛋白V将这种DNA-蛋白复合物连接起来,并通过蛋白VI与病毒衣壳连接在一起。

在两条链的5’端各以共价键结合着一个DNA末端蛋白(TP)复合物(DNA-TPC)的特化的结构,与腺病毒复制密切相关。

腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列(ITR),是复制的起始位点。

腺病毒感染细胞的过程:腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体,病毒纤毛基底部五邻体表面的三肽RGD与细胞表面的αvβ3和αvβ5整合素结合,通过内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体。

在溶酶体中腺病毒衣壳的构象发生变化,从溶酶体中释放出来。腺病毒颗粒转位到细胞核,通过核孔将DNA释放到细胞核内。

 

病毒基因组进入细胞核,进行转录并启动病毒基因组的复制。腺病毒双链DNA的每条单链的5’端有TP蛋白结合,TP通过其Ser-OH与DNA 5’端的dCMP 5’磷酸间形成磷酸二酯键。

 

腺病毒的DNA复制首先是以5’端结合有TP的dCMP作为引物,以3’端的末端反向重复序列为模板,进行链置换合成,置换出的单链分子可以自我退火环化,形成锅柄样环形分子,然后这种环形分子再以相同的机制合成出子代双链DNA分子。

 

环状DNA的复制的末端终止阶段则不存在问题。

环状DNA复制到最后,由DNA拓扑异构酶Ⅱ切开双链DNA,将两个DNA分子分开成为两个完整的与亲代DNA分子一样的子代DNA。

 

3.2.5 DNA复制的保真机制

在长期的进化中,DNA复制过程形成了一系列保真机制,保证复制准确和遗传稳定。

E.coli每复制109~1010nt便出现1个误差。由于E.coli DNA有4.5×106bp,这样每1000个细胞经过1次分裂会产生1个错误核苷酸。

 

①碱基配对原则

单纯以碱基配对原则维持DNA复制准确性时,误差出现频率为10-4~10-5

 

②DNA聚合酶的校对作用

DNApolⅠ有两个结构域:大结构域有直径2nm裂缝,DNA可结合于此而使裂缝关闭,DNA可在裂缝中前后滑动;小结构域含核苷酸结合部位;当新合成DNA中含错配核苷酸时,因双螺旋变形而不能在裂缝中向前滑动,只能后移,3’→5’外切酶激活,切除错配核苷酸。

 

DNA pol的校对作用可将错误的核苷酸切掉,重新加上正确的核苷酸。

每个核苷酸的掺入有两次被选择机会,按碱基配对原则,错误核苷酸掺入机率为10-4~10-5,DNA聚合酶本身的校对作用又可使错误核苷酸掺入的机率为10-4~10-5

这样每掺入一个核苷酸,发生错误的机会只有10-8~10-10

 

③RNA引物起始复制可减少复制错误

DNA复制开始时形成的短核苷酸序列掺入的核苷酸容易出错,DNA合成起始时及冈崎片段合成开始时都有RNA引物。RNA最终被切除可提高DNA复制的准确性。

真核生物DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性。因此,可能存在其他校正机制以保证DNA复制的准确性。

④修复系统有多种机制和酶。

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