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3.3 真核生物的DNA复制
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:12232    更新时间:2011/4/15
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3.3.1 研究真核生物DNA复制机制的选材

一般选用结构简单的真核生物如:酵母、四膜虫以及真核病毒为材料。

真核病毒DNA复制机制与真核染色体DNA复制相同,如SV40

 

3.3.2真核生物的复制子

复制时期在S期。

 

①多复制起点

真核和原核生物DNA复制的基本特征是相同的,但真核DNA比远比原核DNA大,且大多数真核生物是由多细胞组成的,因此在DNA复制上有所不同。

 

 

真核生物的每一个染色体皆含有许多个复制子(replicon)。复制叉前进的速度大约只有大肠杆菌的1/10。

可能原因是真核生物的DNA与组蛋白构成核小体,对复制叉的前进造成阻碍。

人类的复制叉每秒约前进100bp;复制整个基因体需8h。

果蝇的复制整个基因体仅需3~4min。

 

②复制原点的特征

酵母菌的复制起点称为ARS(autonomously replicating sequence),有100多个bp。

ARS由2个功能域组成:A功能域为ARS的中心,可能是起始蛋白的结合位点。A的序列为(T/A)AAATA(T/C)AAA(T/A);

 

啤酒酵母的ARS分布在100~200bp的DNA序列中,ARS包括一个共有序列(A)和附加元件(B1~B3)。A元件在芽殖酵母中高度保守,是复制起始所必需的。其中有富含AT的11bp序列是复制起始识别复合物(origin recognition complex, ORC)结合复制起始位点所必需的,对起始因子在复制起始位点的组装起基本作用。

 

B1元件紧靠A元件,也是ORC的识别序列。B2元件的功能还不清楚,可能参与双链DNA的解旋。B3元件是转录因子Abf1的结合位点,可促进DNA复制的起始。B功能域富含AT,可能是DNA熔链区。

A元件决定哪一段DNA序列作为复制起始位点,B元件可以增加复制起始位点的效率。

 

不同生物复制起始位点的共同特征

多个短重复序列。

重复序列被多亚基的复制起始位点结合蛋白识别,这些蛋白对于复制酶在复制起始位点的组装起关键作用。

复制起始位点附近一般都有富含AT的序列,以利于DNA双链的解旋,产生DNA复制模板。

 

ARS序列突变对复制有影响。

真核生物Yeast约有400个自主性复制序列(ARS)分布于16条染色体中。每一个复制子长约36kb。

 

多细胞生物的复制起始位点有多个,在基因组中的分布也不是随机的。在基因组复制过程中只有一些复制起始位点起作用,这可能与染色体结构、基因转录、生物发育过程和DNA甲基化等因素有关。

例如在动物的发育过程中,细胞周期的S期在胚胎期可以只有几分钟,而在成熟组织中可以长达几个小时。DNA复制在S期的及时完成主要取决于有效复制起始位点的增加,而不是复制叉移动速度的增加。

 

复制起始位点可以决定基因组在S期复制的时间顺序。即真核DNA的各个区域不是全部同时复制的,一般是20~80个相邻复制子一次被活化,S期中不断有新的复制子被活化,直至整个染色体完全复制。事实上,在酵母染色体中,不同位点的复制起始位点的效率和起始时间是有显著不同的。

 

DNA复制后立即与组蛋白H32·H42四聚体4和H2A·H2B二聚体结合成核小体结构。

 

3.3.3 真核生物DNA pol和蛋白因子

3.3.3.1 真核生物DNA pol

真核生物也有多种DNA pol,通常细胞中有15种以上。其中参与基因组DNA复制的酶有DNA polδ、e和a。

真核生物中的DNA聚合酶聚合反应机制与原核生物的相似。

真核DNA pol的种类

 

①DNA polα:含量最高(占总量80-90%),有4或5个亚基,MW为300KD,负责合成RNA引物和iDNA(initiator DNA,起始DNA)。形成RNA–iDNA引物,具引物酶活性,无3’→5’活性,错配频率高。

主要负责染色体DNA的复制。

 

②DNA polδ:无合成引物功能,有3’→5’外切活性,负责合成延伸前导链和滞后链的冈崎片段(延伸)。

③DNA polε:或参与滞后链合成或与polδ相同,参与DNA复制。

④DNA polβ:分子量为45KD,仅含有一条链,可能与修复有关。

⑤DNA polγ:MW为140KD,存在于线粒体内,负责催化线粒体DNA的复制。

3.3.3.2 复制有关的细胞因子

真核基因组在一个细胞分裂周期中每个复制原点仅活动一次,这是由细胞中的一些蛋白因子控制的。

 

①准许复制因子

准许复制因子来源于细胞质,进入细胞核控制DNA复制,DNA复制后因子失活,同时细胞质产生两个准许因子进入G2期,核膜消失,胞质中的准许因子进入核,核质分裂为二,细胞分裂,2个准许因子分别进入两个子细胞的核,这是细胞质因子对复制的调控作用(核质互作)。

 

Licensing factor in the nucleus is inactivated after replication. A new supply of licensing factor can enter only when the nuclear membrane breaks down at mitosis.

 

酿酒酵母(S. cerevisiae)准许因子的成分由其Mcm2、3、5提供,这些蛋白质是复制所需的并只有在有丝分裂时进入细胞核。在动物细胞中也发现了同源物。

Mcm3在复制前受到染色体物质的约束,但在复制后被释放。动物细胞的Mcm2、3、5复合物在整个细胞循环中都保存在核中,暗示了它可能是特许因子中的一个成分;另一个成分可能只在有丝分裂时进入,可能对于Mcm2、3、5与染色体物质的连接是必须的。

 

②Mcm(minichromosome maintenance proteins,微染色体支持蛋白,Mcm)

Mcm是一个由6种蛋白组成的家族,包括Mcm2到Mcm7。Mcm家族是以多蛋白复合物的形式发挥作用的。它们在真核生物的进化过程中是相当保守的。

 

哺乳动物细胞在G1期Mcm与DNA复制的起始位点相互作用。参与DNA复制过程。

Mcm4,6,7组成的复合物在体外具有DNA解旋酶的活性,表明它可能是真核生物复制过程中的解旋酶。其解旋活性可被Mcm2的结合抑制,这可能是防止在一个细胞周期中再次发生DNA复制的机制之一。

 

③ORC(复制起始识别复合物,origin recognition complex)由6个亚基组成,可与酵母复制起始位点中的A元件以及B1元件相互作用。

 

ATP、ORC和复制起始位点相互依赖地结合形成ORC-DNA复合物,被结合的ATP可以被很慢地水解,可能参与其它起始因子结合ORC或者DNA双链的解旋。

ORC在真核生物中是相当保守的。ORC或者其亚基已经在裂殖酵母、有爪蟾蜍、黑腹果蝇和人中发现。

 

④Cdc6/Cdc18

啤酒酵母中的Cdc6(cell division cycle genes)以及裂殖酵母中的Cdc18是DNA复制的关键调节物。Cdc6和Cdc18对DNA复制的起始有重要作用。

Cdc6和Cdc18的同源物已在蟾蜍和人中发现,表明它们在真核生物进化过程中是相当保守的。将人Cdc6的抗体微注射入人体细胞,发现细胞不能进入细胞周期的S期,这说明人Cdc6对于人DNA的复制也是必不可少的。

 

⑤Cdc45

Cdc45是DNA复制起始所必需的。在细胞的G1期,Cdc45可以和DNA的复制起始位点相互作用。这种作用是Cdc6和Mcm2依赖的。Cdc45在DNA复制刚起始后,参与招集DNA pol α至起始复制复合物,还起到连接Mcm和DNA pol α的作用。

 

⑥PCNA(proliferating cell nuclear antigen)

增殖细胞核抗原,为同源三聚体复合物,结构为环形。

功能类似于E. coli DNA pol Ⅲ β(clamp),使DNA polδ有持续合成能力。

 

 

⑦RFC(Replication factor C):复制因子C

RFC有依赖于DNA的ATPase,其ATP酶活性由PCNA激活;RFC是促进活性复制复合物组装的蛋白;引物合成后取代pol α,使polδ继续延伸DNA。

⑧RNaseHⅠ/FEN1(flap endonuclease)

RNaseH I:内切酶切除5′端RNA引物,但剩余引物最后一个N。

FEN1:5′→3′外切酶,切去引物最后一个N。

 

⑨Dna2解旋酶/FEN1(内切酶活性)

Dna2解旋酶:在引物消除中起作用。依赖DNA的ATPase活性,使polδ合成的片段从模板DNA上置换下前一个冈崎片段的引物,形成flap,再由FEN1内切酶活性切除引物。

⑩RFA为真核单链DNA结合蛋白;

LigaseⅠ:连接两个冈崎片段。

 

3.3.4 SV40 DNA的复制

真核生物的复制比原核生物要复杂得多,基因组大,复制速率慢,需要多个复制起始位点。对真核生物复制起始的认识,是以哺乳动物病毒SV40为材料进行研究的。

SV40 DNA的复制

SV40基因组是环状双链DNA(5243bp),有一个Ori,DNA起始复制时需要其本身编码的T抗原,其它参与复制的组分则来自宿主细胞。常用带SV40 Ori顺序的质粒作为研究真核细胞DNA复制的体外模型。

 

SV40编码的T抗原是一个多功能蛋白,其N端(135~249氨基酸残基)是DNA结合区,能识别SV40 Ori区的重复序列GAAGC。C端(371~625氨基酸残基)有解旋酶活性。T抗原与Ori区结合后,能沿着DNA链从3’®5’方向移动,在ATP和复制因子A(RFA)协助下,其螺旋酶活性使Ori区的双链解开。T抗原还能与DNA pol a结合,引导DNA pol a结合到单链DNA上,合成RNA引物。

 

SV40的染色体中有一个64bp的区域是其复制起始位点。在基因组5230~10之间的区域含GAGGC反向重复序列,是大T抗原识别和结合部位之一(大T抗原结合区II),其右侧为A/T富含区域,其左侧15bp中含有CTACTTC的反向重复序列。

 

SV40体外复制实验证明至少需要8种蛋白质(或酶)的作用才能完成复制。包括:T抗原、拓扑异构酶Ⅰ或Ⅱ、复制因子A(RFA)、复制因子C(RFC)、PCNA、DNA pol a-引物酶复合物、DNA pol d等。

 

①起始:T抗原→RFA→Polα→引发体。

T抗原先形成多亚基复合物,在ATP存在下与SV40 Ori区结合,利用它的3’-5’解旋酶活性在Ori区引起DNA解链,在RFA和拓扑异构酶协同作用下形成前引发复合物,促使DNA进一步解旋解链,并与DNA pol a结合形成引发体,Pol a的引物酶活性起始RNA引物合成。

 

 

②RNA-iDNA引物合成:DNA polα先合成RNA引物,再合成一个短的iDNA形成RNA-iDNA引物。

RFA是单链结合蛋白,它允许T抗原进一步解开SV40的DNA链。DNA pol α/引发体起始DNA双链的合成。引发反应是从RNA开始,但RNA引物由DNA pol活性来延伸,提供一个短(3~4nt)DNA序列,称为iDNA。

 

③DNA polα/δ转换和链的延伸

RFC与iDNA的3末端结合,并加载DNA polδ和PCNA,从而使DNApol a解离,发生DNA pol a向DNA pol d的转换。在这个系统中,SV40的T抗原是作为解旋酶,并加载复制机构;但不知道在真核宿主细胞中谁起这个作用。

 

在复制叉有两个DNA polδ(二聚体)通过与PCNA及RFC的作用结合到引物末端开始合成前导链和滞后链。DNApol d可完成全部前导链的复制合成。

但是滞后链不能连续复制合成,要不断地引发引物RNA的合成,在RFC和PCNA参与下向pol d转换,由DNA pol d继续合成冈奇片段,当DNApol d接近下游的冈奇片段的RNA引物时pol d解离。又在上游引发另一个冈奇片段合成的起始。

 

④冈崎片段的引物切除和片段连接

滞后链新冈崎片段合成在遇到前一个冈崎片段时停止。RNaseHI/FEN1切除引物。iDNA在Dna2解旋作用后被新生的冈崎片段置换,再被FEN1切除,形成的空隙由DNA polδ(or ε)负责填补。(实际合成中后一个冈崎片段和前一个冈崎片段引物后是连续的?)。

LigaseⅠ连接冈崎片段。

DNA polδ和DNA polα转换的意义?

 

 

3.3.5 真核线粒体DNA的复制

真核细胞内线粒体DNA的复制方式为D-环复制(D-loop复制)形式。D-环复制特点是两条链的不同步复制。

线粒体DNA的双股链因浮力密度不同可区分为重链(H-链)和轻链(L-链)。

 

①H-链首先合成

在复制起点处以L链为模板合成RNA引物,由DNA polγ合成H链片段并与L链以氢键结合形成双螺旋结构,将亲代的H链置换出来,产生一种D环复制中间物。

 

②L-链的合成

当H-链的复制进行到2/3基因组的位置时,L-链的复制起点被暴露,以被置换下来的亲代H链为模板,开始合成L-链DNA,合成也需要RNA引物。

 

③复制的完成

H链的合成提前完成,L链的合成随后结束。

线粒体DNA合成速度缓慢(10nt/sec),整个复制过程需要1个小时。刚刚合成的线粒体DNA是松弛型的,需要40分钟将其变成超螺旋型。

 

3.3.6 真核细胞DNA复制起始

真核生物中,染色体DNA的复制仅发生在细胞周期的S期。这种保守的机制被称为“准许机制”(licensing mechanisms)。

在体外,蟾蜍卵提取物可以启动DNA模板的复制。在复制起始前,蟾蜍的ORC、Cdc6和MCM都与染色体复制起始位点相互作用,它们是复制起始所必需的。

 

复制起始——真核细胞前复制复合体的形成

G1期,参与复制的有关因子首先对复制复制起点进行识别,在每个复制起点上组装形成一个蛋白复合体。

 

细胞进入S期后与复制起点结合的蛋白复合体启动DNA的解旋和DNA聚合酶的募集(但原核细胞中蛋白因子对复制起点的识别和DNA解旋及聚合酶的募集相耦联),真核细胞的这两个过程被短暂分离保证了在每个细胞周期中每条染色体仅复制一次。

 

S期的起始时间的控制是由前复制复合物(Pre-replication complexes, Pre-Rc)在复制起始点的组装决定的。

首先,ORC识别复制起点。ORC由6个蛋白质组成的复合物,在细胞周期的所有阶段都在复制起始点位置,它是Pre-Rc复合物组装的平台。

 

ORC结合后募集两个解旋酶装载蛋白Cdc6和Cdtl(解除复制起始抑制因子geminin的作用)。

 

Cdc6为短命蛋白(半衰期﹤5min)。它在G1晚期合成并跨过G1期,并在有丝分裂结束与G1晚期时间与ORC结合。它快速降解使在以后的细胞循环中不能获得此蛋白质。Cdc6与ORC结合形成起始复合物。Cdc6此时起保护位于B1上的Dnase敏感位点。

 

ORC和装载蛋白共同募集Mcm2-7复合体(可能具有解旋酶活性),形成pre-RC。

 

细胞进入S期后,pre-RC被蛋白激酶Cdk(cylcin -dependent protein kinase)和Ddk(Cdc7/Dbf4)激活,使复制得以启动。而蛋白激酶只有在细胞从G1期进入S期后才能被激活。活化的激酶可激活pre-RC和其他复制蛋白,导致它们在起始位点上的组装及复制起始。包括3种DNA聚合酶及其募集所需的其他蛋白质。

 

聚合酶在起始位点的组装是以DNA聚合酶δ和e先结合,聚合酶a后结合的顺序进行,然后才合成第一个RNA引物。

 

由于Cdc6在S期被快速降解,它不能再次负载Mcm与复合物结合,所以复制起点在S期不能被再次起始。

虽然G2期ORC仍结合于ori,但由于无Cdc6和Mcm,复制不能起始。

细胞周期控制着Cdc6的合成,而Cdc6又控制着复制。

 

 

多细胞生物在DNA受伤后复制将引起突变积累,最终可致肿瘤发生。进化中,真核细胞有一套可检测基因组是否受损伤的机制。在进入S期和M期前,细胞将对内部状态进行检测,只有通过检测基因组才被允许复制。不能通过检测的细胞将停止周期的进行,直到DNA被修复,或者被迫进入程序性死亡或凋亡。

 

P53蛋白是指导哺乳动物细胞周期暂停或凋亡的核心成员。 P53是顺序专一性DNA结合蛋白,它可激活许多直接负责停止细胞周期进行和凋亡的基因,也抑制其他具有相反作用的基因表达。当P53蛋白发生缺陷时,有损伤的基因组可能逃过监测而变为癌细胞。

 

3.3.7 真核生物端粒的复制

3.3.7.1 端粒(telomere)

端粒位于真核生物染色体DNA的3’末端,由独特的DNA重复序列及相关蛋白组成的复合体。

端粒的功能:

①维持染色体的完整性,决定细胞的寿命。若无端粒,两个染色体末端很可能融合一起。

②解决末端复制问题。端粒酶能与端粒作用,延伸其长度。

 

产生端粒问题的原因是DAN复制需要引物,而RNA引物最终被降解,可能导致线状DNA端部不断变短,信息丢失。

 

3.3.7.2 端粒的结构

①DNA端粒由简单的串联重复序列组成

人和其他脊椎动物:AGGGTT

纤毛原生动物四膜虫:GGGGTT和GGGGTTTT

面包酵母:G13T和G15A

共同特点:富含G;长度达几百到几kb;人类DNA端粒长几kb到几十kb。

 

②端粒DNA序列有取向性:染色体末端,富含G的单链为5’®3’延伸,并长于富含C的单链12~16nt。

③染色体末端与特定蛋白形成复合物。

 

④端粒的不寻常结构

In vitro(体外,实验室条件下)可产生G-G配对。3’端12~16bp突出序列形成回折结构,甚至形成4链结构,其中G形成G四联体,并为K+或Na+稳定,且四联体上下堆积。

 

染色体DNA末端形成一个环状结构(动物细胞环的长度约为5~15kb)。

 

环是由端粒的3’单链末端取代双链DNA中的同源区形成的,这个过程由TRF2催化。

 

3.3.7.3 端粒的复制

端粒酶(Telomerase)是催化端粒合成的酶。它是由一条RNA和多种蛋白质构成的核糖核蛋白复合体。端粒酶中的蛋白部份具有逆转录酶活性,能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。

 

端粒酶的作用机制:端粒酶的RNA分子与端粒DNA配对,以RNA为模板进行类似逆转录合成DNA,向5’→3’延伸端粒至模板RNA末端后,延长的DNA末端与RNA模板解离,端粒酶移动,重新定位于延长后的DNA3’端,开始下一轮延长过程,如此反复可达数百次合成几百个或数千个重复序列。

 

引物酶及DNA pol按合成滞后链方式延伸另一链。虽然滞后链仍比模板链短,但整个DNA已被加长。可避免DNA随复制而逐渐变短。

 

 

最后以延长的DNA链为模板,由引物酶-DNA聚合酶合成富含G的另一条链,完成端粒的复制。

 

端粒酶与老化

1986年Howard Cooke发现端粒长度在体细胞内比在生殖细胞内短。并发现端粒酶在生殖细胞内经常被表现出来,所以端粒的长度一直保持在15kb左右。端粒酶在体细胞中无活性或活性低。

 

大多数体细胞不合成端粒酶,每次分裂后端粒就变短(约30~200bp)。

当端粒比正常的长度短数kb时细胞就不再分裂。所以端粒变短是一种老化的象征。

实验证明将端粒酶加进体细胞,可以增加体细胞分裂次数。

 

端粒酶在细胞永生化和肿瘤增殖的维持中起重要作用

癌细胞主要特性是能无限期的分裂增生,这需要不断表达端粒酶。实验发现癌细胞的端粒酶活性很强。这点可被用来检验癌细胞。

原癌蛋白,雌激素等很多因子可激活端粒酶。

 

端粒酶的应用

由于dystrophin基因突变使肌肉细胞很快退化。虽然肌肉细胞(stem cells)能分裂增生新的细胞来取代受损细胞,但经过多次分裂后,端粒变短而无法再增生,表现为肌肉萎缩症(muscular dystrophy)。若将端粒酶引入细胞加强增生的潜力,延缓肌肉萎缩的速度。

治疗端粒酶也可被应用到与老化相关的疾病。

 

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