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4.2 同源重组
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:12927    更新时间:2011/4/15
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同源重组(homologous recombination)广泛存在于生物界。如真核生物姊妹染色单体的交换;细菌及某些低等真核生物的转化;细菌的转导、接合等。

 

4.2.1 同源重组的概念

同源重组(交换crossing over)是两条具有同源序列的DNA靠近时所发生的DNA交换。

 

①真核生物的同源重组发生在减数分裂时,姐妹染色单体间遗传物质间的交换;

 

 

联会复合体将染色体排列在一起

 

②细菌的同源重组发生在接合过程中,交配的染色体在两个紧密接触的细胞中转移。

 

接合引起重组

 

③单细胞内在复制中和复制后的两条同源染色体也可发生交换。

④重组修复中也发生同源重组。

 

4.2.2 同源重组的特点

①要求较大的同源DNA片段(﹥75bp)才能进行交换;同时需要重组酶(RecA)参与。

②同源片段相同或相近,在任何位点均可发生重组,但存在重组热点;

③整个基因组重组频率不恒定,受综合效应和局部效应的影响;卵母细胞﹥精母细胞。女性联会复合体的长度及重组频率都是男性的2倍

 

4.2.3 同源重组的功能

①维持生物种群的多样性。

②染色体瞬间的物理连接,对染色体正确分离到子代细胞中至关重要。

③用于损伤修复。

 

4.2.4 同源重组的机制

4.2.4.1 断裂-复合(breakage and reunion)

⑴ 断裂-复合机制的两种假设

①完整DNA分子的断裂和重接:染色体复制完成后,每对联会染色体有4个染色单体。染色单体收缩产生张力引起DNA整体断裂,断裂的DNA交叉重接解除张力,形成交换产物。

 

断裂和重接模型是Darlington在1937年研究减数分裂时提出的。按照此模型重组应发生在四线期,且是一个相互的过程,所以重组的产物也应当是对称的。但1930年德国的Winkler已发现了基因转变现象,即链孢霉重组的产物并不都是接4:4分离,也会出现5:3和6:2(基因转变)的分离比,断裂重接模型对此无法解释。

基因转变(gene conversion)是基因内部不同位点之间的重组。

 

1955年人们已认识到基因是DNA分子的一部分,当遗传学家发现基因的转变说明基因内重组时更加怀疑断裂重接模型的正确性。特别是考虑到此模型要求两条非姊妹染色单体必须要在相同位点的核苷酸之间发生断裂,否则会产生非法交换,然而张力引起的染色单体断裂很难达到如此之精确。

 

这使人们寻求一种能够解释基因转换的新模型,于是模板选择学说受到了推崇。当时虽然还不清楚DNA半保留复制的过程是怎样进行的,但在20世纪50年代大部分遗传学家都倾向于模板选择说。

 

②拷贝选择(copy choice):配对的染色体在复制中途,交换了各自的模板。

 

Belling J.首先提出了模板选择学说,1933年他又撤回了这一假设。1948年Hershey发现在噬菌体的杂交中产生的重组子有时是非对称的,为了解释这个现象,他接受了Sturtevant. A. H的建议,提出了在噬菌体中重组可能不是遗传结构的断裂和重接,而是复制时改变了模板所致。即两条染色单体作为复制的模板,新的染色体各以一个单体模板进行复制,在复制过程中相应交换模板,从而造成重组。

 

模板选择模型能够很好地解释基因转变的现象,因此被广泛接受。由于当时半保留复制等有关机制尚不清楚,若根据现在已知的理论,模板选择学说不成立:①模板选择假设提出一条姊妹染色体单体以另一条单体为模板进行复制这本身就违反了半保留复制的原则,这属于全保留复制;②在真菌中可以观察到染色体单体的三线和四线交换,而模板选择模型仅限于二线交换;③染色体的配对、交换应在细胞周期的分裂期(M),而复制是在S期,因此重组不可能是和复制同时发生。

 

⑵ 断裂-复合中的几个概念

①异源双链(heteroduplex):在重组部位,每个双链中均有一段DNA链来自另一个双链中的单链。这个部分称为异源双链(杂种DNA)。

 

②分支迁移:异源双链交叉连接中,交叉点沿着两条双链移动,称为分支迁移(branch migration)。

 

 

③Holliday结构:两个DNA分子交叉重组时,在连接处则形成一个“四螺旋”作为中间物。这种结构称为Holliday结构(交叉结构)。双链侵入、单链侵入和双链断裂修复等均可形成Holliday结构(Robin Holliday,1964)。

 

 

连接分子的拆分

Holliday结构可发生立体或空间重排,使得作为“桥”的链(即连接两条螺旋的交叉部分)转变为“外部”链,而原来的外部链则转变为“桥”链。

 

最后由核酸酶将交叉处切断(解离resolution)而完成重组作用。这种异构转变可导致两条子链发生双重交换,或所有四条链发生单交换。

 

重组体

 

4.2.4.2 双链断裂启动重组

①在受体DNA链上形成双链断裂;

②通过核酸内切酶扩大受体切口,产生3’-端单链;

 

③受体3’-端迁移至供体同源区;

④受体3’-端修复延伸合成;

⑤供体置换、链迁移至受体链;

⑥在受体上的另一个3’-端DNA合成;

⑦相互迁移产生双链交换。

 

4.2.4.3 细菌重组酶

在重组反应中活性最为明显的是由大肠杆菌染色体上rec基因和ruv基因编码的一些酶。

RecBCD酶:它的各个亚基是由recB、recC、和recD基因编码的。

RecBCD酶的活性包括:①强的核酸酶活性可降解DNA;②解旋酶活性,在SSB存在时它可解开双链;③ATPase活性。

 

RecBCD酶在重组中的作用是与双链断口结合,解开DNA链并导入裂口,产生带有游离3’端的单链区。

然而,至今还未发现细菌有引入双链断裂功能的蛋白。因此,认为DNA损伤和复制叉停滞等原因是产生双链断裂的主要来源。

 

RecBCD酶的倾向性位点为chi。在E. coli中每隔5~10kb有一个拷贝。

chi由8个碱基组成的非对称序列:

5’GCTGGTGG3’

3’CGACCACC5’

当RecBCD结合在DNA Chi位点的3’侧时,它沿着DNA向5’移动使DNA解旋,并降解带有3’端的单链。

 

当到达Chi位点时停顿下来,并切开chi 3’侧的一条单链DNA,切点距Chi 3’侧4~6bp处。Chi位点的识别导致RecD亚基解离或失活,结果使复合物RecBC失去核酸酶活性,但继续发挥解旋酶作用。

 

RecBCD 切割产生3’单链末端

 

RecBCD介导的解旋和剪切可产生3’游离末端,用来起始异源双链连接的形成。当RecBCD在Chi位点剪切时RecA酶能使带有3’末端的单链释放出来,并利用它和同源双链序列起反应,从而产生连接的分子。

 

RecBCD结合在双链DNA末端利用解旋酶活性解开双螺旋,由于解旋速度大于释放ssDNA的速度二形成“Rabbit ears”。

SSB及一些RecA与单链区DNA结合,RecBCD核酸内切酶活性随即切开ssDNA,它更倾向于切割3’端链而不是5’端链。

 

当RecBCD遇到Chi位点,被切割链的3’端位于chi位点后4~6bp处。

RecBCD指导RecA结合到3’端链,同时RecBCD的内切酶活性更多作用于5’端链。

RecA与3’端ssDNA结合形成核蛋白纤维,它可与同源dsDNA进行配对和链交换。

 

RecA蛋白是催化重组基本反应的酶,能通过碱基配对使两个DNA连接成杂交分子。RecA可使单链DNA取代双链DNA中的同源部分。

但两双链中必须有一个DNA分子具单链区。其中一个DNA分子必须要有一个游离的3’末端,同时单链区和具3’端的DNA必须有互补区。

 

两个双链分子可在RecA引发下相互作用,入侵的单链置换双链中的同源链。但当反应到达两个分子都是双链的区域时,入侵链与双链中的对偶链即解链,对偶链再与被置换的链配对。

 

 

ssDNA结合在RecA的第一位点,dsDNA松散地结合在RecA的第二位点,RecA扫描dsDNA的同源区而引起DNA链交换,形成的异源双链区进一步形成Holliday结构。

 

在RecA作用下,单链区也可插入环状分子中。

 

RecA的性质

RecA,MW38kD,有单、双链DNA结合活性,也具有NTPase活性(与单链DNA结合时活性最大);

RecA与单链DNA结合时,数千RecA单体协同聚集在单链上,形成螺旋状纤丝。RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。

 

Rec A可与双链DNA作用,部分解旋以便阅读序列,迅速扫描寻找与单链互补的序列。一旦找到互补序列,双链进一步被解旋以允许转换碱基配对,使单链与双链中的互补连配对,同源链被置换出来。

 

在体外RecA引发的反应可产生Holliday结构,说明RecA可催化互补链发生迁移。

 

在重组后期发挥功能的一组酶:大肠杆菌中存在有由3个基因ruvA、ruvB和ruvC编码的一组酶。

RuvA和RuvB能增加异源双链结构的形成。RuvA识别Holliday连结体的结构,在交换点处与DNA全部的四条链结合,形成中间夹着DNA的两个四聚体。

RuvB是一个六聚体ATP酶,它有解旋酶活性,为分支迁移提供动力。RuvB六聚体在交换点上游与每一个DNA双链环绕结合。

 

RuvAB复合物能使分支以10~20bp/s的速度移动。RecG解旋酶有相似的活性。在其作用过程中,RuvAB把RecA从DNA上置换出来。RuvAB和RecG活性都能作用于Holliday连结体,完成重组。如果二者两个都发生突变,则大肠杆菌完全失去重组活性。

 

ruvC编码专一识别Holliday连结体的一种内切核酸酶。在体外它能切割这种连结体,拆分重组中间体。

RuvC的作用热点是一个共有四核苷酸序列(ATTG),此四核苷酸是不对称的,这样可以直接拆分被切割的配对链。这决定产生异源双链结构还是重组体。

 

4.2.4.4 单链断裂启动重组

1975年,Meselson和Radding在Holliday模型基础上进行改进,以解解释双链在某一位点同时断裂的偶然事件,而单链断裂是经常发生的事。

认为同源DNA分子中只有1个分子发生单链断裂,随后单链入侵另一DNA分子同源区,造成链置换,被置换的链再切断并与最初断链连接,即形成Holliday中间体(Meselson-Radding模型)。

 

DNA单链形成可在一条DNA双链中首先产生,随着缺刻处DNA链的修复合成,游离出的单链末端侵入相邻DNA双链中,与同源部分配对结合,被替换的DNA链形成一个逐渐增大的D-loop。

 

核酸酶切除未配对的D-loop,产生的单链末端交叉侵入相邻DNA双链中,DNA自由末端共价连接形成Holliday结构。

 

Meselson-Radding模型将DNA合成与重组联系起来,这种DNA杂合链形成机制似乎更利于解释非对称重组现象。

 

 

1984年Lin等人提出了单链退火模型解释同源重组。

一些人也提出了其它重组模型,如Rao等发现在RecA蛋白的参与下,单链DNA分子进入DNA双螺旋主沟,在同源区域形成稳定的三链结构。其它人的研究也发现类似的三链DNA结构,认为DNA分子的三链结构可能在同源序列识别和重组中起重要作用。

 

同源重组除可在DNA分子间进行外,还可在RNA分子间或RNA与DNA分子间进行。Stuhlmann等发现逆转录病毒RNA在逆转录中发生高频同源重组,这一现象在其它RNA病毒中也被证实。

 

Derr等在酵母S. cerevisiae中发现,RNA分子可通过cDNA途径介导基因组DNA同源重组,提出RNA介导重组模型(RNA-mediated recombination)。RNA分子间及RNA介导的同源重组可能提供基因组变异的新途径。

 

Homologous recombination between two circular DNA duplexes.

This process can result either in two circles of the original sizes or in a single composite circle.

 

(a) Electron micrographs of intermediates in the homologous recombination of two plasmids.

(b) A chi structure that results from the treatment of a “8” structure with a restriction endonuclease. Note the thinner single-stranded connections in the crossover region.

 

4.2.5 细菌的基因转移与重组

细菌细胞间的基因转移具有多种途径,这有利于适应环境。

细菌的基因转移包括:接合(conjugation)、转化(transformation)、转导(transduction)和细胞融合(cell fusion)。

外源基因在受体细胞中的结局:可能被降解或临时保留或与内源基因置换以及整合。

 

4.2.5.1 接合

接合作用:当两个细菌细胞相互接触时,遗传信息可由一个细胞转移到另一个细胞。

这种能力是由接合质粒(conjugative plasmid)提供的,它可编码与接合有关的蛋白质。一般称这种质粒为致育因子、性因子或F因子。

 

4.2.5.2转化

遗传转化(genetic transformation):细菌吸收外源DNA而改变遗传性状的过程。

具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competent cell)。

 

固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏球菌和嗜血杆菌等在自然条件下就有吸收外源DNA的能力,虽然感受态经常是瞬时的,与特定的生理状态有关。转化过程涉及细菌染色体上多个基因编码的功能。

一些人工处理可促使细菌转化。大肠杆菌用一定浓度Ca2+处理可诱导细胞成为感受态。

 

4.2.5.3 转导

转导(transduction):通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。

转导的两种类型:

①普遍性转导(generalized transduction):宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌。

 

噬菌体感染宿主并进行繁殖,同时使宿主DNA降解为小片段,噬菌体装配时可能误将细菌的DNA片段装入噬菌体的头部,成为一个转导噬菌体。转导噬菌体感染另一宿主菌将其头部的染色体注入受体菌内。

 

偷渡的DNA与新宿主可能发生重组

 

②局限性转导(specialized transduction):某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的特定DNA切割下来带走,而将自身的一段DNA留在细菌染色体上,取代病毒DNA。

 

 

4.2.5.4 细菌细胞融合

在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。

在实验条件下,用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖而成为原生质体,可人工促进原生质体的融合,由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。

 

4.2.6 重组修复

细菌重组修复

双链断裂的修复

 

复制过程的修复

单链断裂的修复

 

Double stranded breaks(DBS)

细菌的同源重组修复主要是用来修复DBS,真核的同源重组修复可解决复制叉的损伤。

 

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