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4.3位点专一性重组(site-specific recombination)
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:3768    更新时间:2011/4/15
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4.3.1 概念

位点专一性重组是在专一酶作用下,在DNA特定位点上发生的断裂和重接,从而产生精确的DNA重排方式。

噬菌体溶原途径中的整合、抗体基因的重排等都是位点专一性重组。

 

4.3.2 特点

①位点专一性重组不依赖于DNA序列的同源性(也可有很短的同源序列),而依赖于DNA上专一位点(DNA序列,通常14~50bp,序列有的相同,有的不同)引起。

②位点专一性重组依赖于专一的酶识别(目前发现的重组酶有100多种),在酶的催化下,DNA链断裂和重接。

 

③位点专一性重组是在细胞中特定的条件下发生的,它可参与某些蛋白质的表达(如抗体基因),这种专一性的酶是被细胞中的调节因素引发的。

④重组后,原先存在的DNA顺序全部被保存下来,并无丢失(保守重组)。

 

位点专一性重组与同源重组的区别

                  位点专一性重组            同源重组

位点              同源短序列              同源大片段

酶、蛋白          专一                           RecA

断裂                  专一                            随机

 

4.3.3 位点专一性重组的机制

λ噬菌体有溶源和溶菌两种状态的生活型。

在溶菌状态时,λ噬菌体DNA以环状分子独立存在于寄主细胞中;

在溶源途径时,λ噬菌体DNA能通过重组作用整合进E.coli染色体的特异位点,成为前病毒(provirus、前噬菌体,prophage)。

 

λ的整合作用有两个特点:

①这种交换是可逆的,原先存在的DNA顺序全部被保存下来,并无丢失;

②噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列,重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。

低等生物λ-DNA→E. Coli-DNA;高等生物的抗体基因重组都属于位点专一性重组。

 

4.3.3.1 λ噬菌体的整合(integration)

λ噬菌体DNA编码的λ整合酶(integrase)能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。

λ噬菌体和宿主的DNA分子都有特异位点(小段同源序列,称为附着点att,attachment site)。

 

噬菌体的DNA借着att与大肠杆菌的DNA靠在一起后,其整合酶即与att结合,催化整合反应,将两个环状DNA分子变成一个大环。

 

①细菌DNA和λ-DNA的专一附着位点

λ噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点为attP和attB。

 

attB和attP中有相同的核心序列。整合酶与两个核心相结合。整合酶不但要求特异的序列,且要求两个核心序列有同源性。

 

 

attB由BOB’的序列组成,attP由POP’组成。核心序列O是attB和attP所共同的。两侧的序列是B,B’和P,P’,被称为臂。

 

②整合蛋白

整合过程需要整合酶和整合作用宿主因子(IHF,integration host factor),

IHF是E.coli染色体DNA上himA和himD编码的,由两个亚基组成,MW:20KD。

him突变阻止λ位点专一性重组的发生。

 

在λ噬菌体感染早期λ-DNA编码的整合酶(integrase, int)大量表达,因此,整合作用几乎发生在每个被侵染的细胞中。

 

③λ噬菌体的整合过程

当整合反应发生时,int识别attP,int和IHF结合形成整合体(intasome)。int蛋白交错切割(staggered cut)attP(λ)和attB(E.coli),互补链进行交叉杂交(互补单链为7b),即在attP和attB处发生交叉重组,封闭连接端切口。

 

重组酶的4个亚基分别切开2条双链DNA分子的每条单链完成重组。过程类似于拓扑异构酶的作用。

酶的2个亚基的Tyr残基分别进攻DNA,形成DNA的3’端以磷酸二酯键与Tyr相连,释放出5’-OH端。然后,每个位点的游离5’-OH端进攻另一位点的3’-P-Tyr,产生Holliday连接。酶的另2个亚基重复此过程使Holliday结构解离。

 

噬菌体整合发生在一个包含宿主蛋白IHF的大复合体中。

多个Int蛋白可将attP组成整合体,通过识别游离DNA上的attB整合体启动重组。

 

位点特异性重组并非重叠单链末端的退火过程。实际上,每一个双链上相对应的链在同一个位置上被切开,双链间交换游离的3’末端。分支沿着同源区移动7bp长的距离,然后,互补的单链末端交互杂合,连接并完成整合过程。

 

噬菌体DNA是环状的,重组时被整合入细菌染色体中,成为线性序列。

前噬菌体DNA的两侧成为两个新的杂交att位点,左侧称为attL,由BOP’组成;而右侧为attR,由POB’组成。

 

4.3.3.2 λ噬菌体的切出过程

虽然重组事件是可逆的,但不同的条件决定了反应的方向。这在噬菌体生活周期中是一个重要的特点。噬菌体一旦整合进入溶原周期不会立即被切离,反之也然。

如果λ前噬菌体受到诱导(induction)时则整合作用将被逆转,此过程称为切离(excision)。切出后细菌和噬菌体DNA恢复至原来完整状态。

 

整合和切离反应作用位点是不同的,因此这两个反应所依赖的蛋白也不完全相同。

整合(attB×attP)反应需要噬菌体int基因的产物和宿主的整合因子(integration host factor, IHF)。

 

切离(attL×attR)需要噬菌体xis基因产物及Int和IHF蛋白参与。整合和切离都需要Int和IHF,但Xis控制反应方向。它是切离所需要的,抑制整合作用。

 

IHF是由基因himA和himD编码的2个亚基组成的蛋白。him基因突变会阻断λ位点特异性重组,也能被int突变所抑制,表明IHF和Int可相互作用。

位点特异重组可通过Int和IHF在体外来完成。它涉及精确的断裂和重接而不需要任何DNA合成。attP的功能需要一个240bp序列,而attB仅需23bp的片段就具有功能,核心区每侧仅需4bp。在核心区中有7bp是交错剪切的序列。

 

attB和AttP的大小就表明它们在重组中所起的作用是不同的。AttP提供了附加的信息,以区别于attB。

很多位点特异重组复合体都是调节反应所需的,所以当病毒进入溶原状态时整合先进行;当原噬菌体进入裂解周期时,先进行切离。通过Int和Xis量的控制将进行相应的反应。

 

4.3.4 基因的表达的调控

在一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组,会得到两种结果:两个位点之间的片段丢失,或被颠倒。

有些生物能利用这种重组倒置来控制基因表达。DNA的一正一倒两种排列法可以相应地表达两种蛋白质,细胞可根据需要作出选择。

 

生物利用这种机制常常调节体表蛋白的表达。如:锥虫(trypanosomes)的表面抗原千变万化,用以逃脱宿主免疫系统的攻击,这也是通过一系列DNA重排达到的。

沙门氏菌(如鼠伤寒沙门氏菌,Salmonella typhimurium)的鞭毛抗原表达也是这个机理。

 

沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛蛋白质H1和H2的交迭表达。两种鞭毛蛋白的基因位于不同的染色体座位。在某一时期,菌体表达其中的一种,但两种不同时表达。

 

H2基因的启动子位于此基因近旁的一个约1kb长的DNA片段(含hin基因及其启动子,约550bp)上,H2基因和编码H1阻遏物基因rh1紧密连锁,这两个基因协同表达。在启动子两端各有一个26bp的反向重复序列(IRL和IRR),H2的起始密码子在反向重复序列IRR右侧16bp处。

 

当两个反向位点之间进行重组交叉时,位点之间的片段将被颠倒。

 

这两个26bp的反向重复即可用作为核心序列进行位点专一性重组。

当此1kb片段朝向某一方向时,启动子即在H2基因的旁边,故H2基因即被转录。同时,邻近编码阻遏蛋白的基因亦被转录,产生的阻遏蛋白可抑制H1基因的表达。结果是H2表达而H1不表达。

 

相反,如果这个1kb片段朝另一方向,由于H2基因没有启动子而不表达。但同时H1的阻遏蛋白也不再表达,故H1得以表达。

含有hin基因的DNA片段在IRL和IRR间,其产物Hin(Hsegment inversion)蛋白通过反向重复序列之间的交互重组(位点专一性重组)来介导整个片段的倒位。当细胞生长受阻时,Hin活性提高,因而就表达另一种新的表面蛋白。

 

在Mu噬菌体中也有相似的调控噬菌体吸附有关的蛋白基因表达的方式。通过倒位可产生4种(S、U、S’和U’)不同的尾丝蛋白。Mu噬菌体的gin (Gsegment inversion)基因和沙门氏菌的hin基因同源。

 

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