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4.4 转座重组
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:8336    更新时间:2011/4/15
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DNA的转座(移位,transposition)是由可移位因子(transposable element)介导的遗传物质重排现象。是1951年美国遗传学家McClintock在根据玉米染色体的长期观察研究提出的概念。

 

4.4.1 转座子概述

虽然McClintock早就发现转座因子,但人们受基因在染色体上有序排列的传统观念影响而难以接受“跳跃基因”这一概念,直到1967年Shapiro才在E. coli中发现了转座因子。

 

4.4.1.1 转座子的概念

转座子(transposon,Tn)是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。

转座子可反复插入到基因组中的许多位点,它可从基因组的一个位点转移到另一个位点;从一个复制子转移到另一个复制子。

 

在转座过程中,转座子的一个拷贝常留在原来位置上,在新位点上出现的仅是拷贝。它依赖于DNA的复制。

 

4.4.1.2 特点

①转座子是不必借助同源序列就可移动的DNA片段,即转座作用与供体和受体间序列无关。

②原核生物和真核生物都有转座子。

③转座序列可沿染色体移动,甚至可在不同染色体间跳跃(跳跃基因)。

 

4.4.1.3 转座子的发现

40年代B. McClintock研究玉米行为遗传学中发现玉米粒上有色素和斑点的变化,提出在生物体基因中有可移动的控制因子(controlling element)。这些控制因子相连接的基因往往变得不稳定。

 

McClintock在1952年发表了关于转座子的论文,但在1967年Shapiro从E.coli中发现了转座子后,Mcclintock的理论才引起重视,1980年获诺贝尔奖。

 

Shapiro在gal操纵子中发现一种极性突变。gal操纵子的galK、T、E基因分别编码gal激酶(galactokinase, K)、gal转移酶(galactose transferase, T)和gal表异构酶(glactose epimerase, E)。

 

K、T、E酶催化Gal的分解,其中间产物Gal-1-p是有毒的,因此galT-在含半乳糖的培养基上因使Gal-1-p积累而不能成活。

 

因此能生长的应是galT-的回复突变及突变体galK-galT-。

但意外发现galE-galT-也能生存,这种突变型由于Gal-1-P积累是不可能存活的,但却居然生长良好。其原因是由于galE-是极性突变,它的突变使远离操纵位点的galK活性大大下降,因而细胞中不会积累Gal-1-P。

 

这种极性突变不同于一般的极性突变,它的特点是:①能回复突变,表明不可能属于缺失或移码突变;②用诱变剂对其处理并不能提高回复突变率,因此推测可能不是点突变。

因此推测galE-的突变可能也是部分DNA的插入(突变)和切离(回复突变)所致。Jordon、Starlinger和Shapiro等设计了一系列实验来证实这一想法。

 

①密度梯度离心实验:Jordon、Starlinger和Shapiro等分别进行了实验,他们将含有gal+和galm(极性突变,即gal-)λ噬菌体分别分离出,同时加入到离心管中进行密度梯度离心,结果出现了两条带,λgalm的密度>gal+,表明galm有可能具有小片断DNA的插入。

 

②分子杂交实验:将λgalm和gal+进行分子杂交,若有galm有额外片段则在电镜下可观察到它们的存在和所处的位置。实验结果在杂交链上出现了一个额外的茎环结构,长800nt的就是插入序列1(insertion sequence1,IS1)。

 

λgal+/galm杂合双链DNA的电镜照片,出现了棒糖状结构。

 

4.4.1.4 转座子的种类和结构特征

原核生物中发现有简单转座子和复合式转座子

①简单转座子

简单转座子(插入序列,insertion sequence,IS)不含有任何宿主基因。

简单转座子是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。

一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。

 

转座子常常被定位到特定的基因中,造成该基因突变。

IS序列都是可以独立存在的单元,带有介导自身移动的蛋白。IS中则仅含有编码其转位所需的转座酶(transposase)的基因。

 

IS的结构特征:

两端具有20~40bp的反向重复序列(inverted repetitive sequence, IR)或正向重复序列(direct repeats, DR)。

 

转座子两边的反向重复序列变性后形成的发夹结构

 

IS具有1kb左右的编码区,它仅编码和转座有关的转座酶(transposase)。

IS对靶的选择有:随机选择、热点选择和特异位点的选择。

 

IS的转座是在转座酶催化下交错切开宿主靶位点,然后IS插入,与宿主的单链末端相连接,余下的缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补,结果使插入的IS两端形成了DR。

 

IS10R、IR50R和IS903的结构和IS相似,它们作为复合转座子两臂的组件,而不独立存在,称为类插入序列(IS-like elements)。

 

②复合式转座子(composite transposon)

复合式转座子(Tn)是一类除了含有转座酶基因外,还带有其它基因(如某些抗药性基因或其他宿主基因)的转座子。

 

 

复合式转座子两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。

 

两翼的组件有的相同(如Tn903),有的不同(如Tn10)。有的方向相同(如Tn9),有的方向相反(如Tn903,10,5)。有的都有功能(如Tn903,10),有的仅右侧组件有功能。

 

复合式转座子两翼序列表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子,IS序列就不能再单独移动,因为它们的功能被修饰了,只能作为复合体移动。

 

4.4.2 转座作用的机制

转座酶(transposase)与转座子两端以及将要插入的DNA靶序列相结合,然后转位酶在靶上交错切割,同时在转座子的两条不同的链两端各进行单链切断。

产生的转座子游离端和靶序列的游离端相连接,成一个DNA分子。

 

转座时,受体DNA的靶序列 (3~12bp)被复制,使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。

 

转座子在转座作用可分为简单转位作用和复制型转座作用两种。

 

①简单转座作用

转座酶在靶序列上交错切割,同时在转座子的两条不同的链两端各进行单链切断。产生的转座子游离端与靶序列的游离端相连成一个DNA分子。

 

 

转座酶在转座子与受体DNA连接的末端进行第二次切割,即转座子两条链的另一端被切断,并将转座子整个转移到新的受体DNA分子上;而在原来宿主DNA上留下一个的“空隙”。

 

简单转座只是将转座子转移到新的位点上。

 

转座酶在转座子两侧切割产生了3’OH端,谁来产生5’端?

Tn7是TnsA作用产生的。

Tn10和Tn5是自己的3’-OH作用生成的。

IS911产生转座子环

 

 

 

②复制型转座(replicative transposition)

转座子作为可移动的元件被复制,一个拷贝保留在供体原来的部位,另一拷贝插入到受体的靶位点,结果供体和受体都有一个转座子拷贝。

 

在这种情况下转座子不进行第二次切割,而在第一次切割留下的断端处由DNA pol复制转座子的第二条链形成共联体(cointegrate)。

 

转座酶作用产生3’-OH端,转座子的3’-OH进攻靶位点。

 

然后由解离酶(resolvase)催化两个转座子拷贝间进行拆分,从而产生两个分离的DNA分子,每个均带有一个拷贝转座子。

 

原则上共联体能够被转座子两个拷贝任一对相应位点之间的同源重组所分离。但Tn3的分离反应仅在特异位点发生。

 

 

两个IS10单位组成一个复合转座子Tn10,该转座子可移动IS10之间的任何DNA序列。如果Tn10是环形分子的一部分,那么IS10末端重复可将环两端任何一端进行转座。

 

4.4.3 转座的遗传学效应和意义

4.4.3.1 转座的遗传学效应

① 转座引起插入突变

IS、Tn都可能引起插入突变(转座频率10-3~10-8)。插入位点若在一个顺反子(cistron)的前端功能基因中,可能造成极性突变。

IS和IS2碱基序列中有无义密码子。

极性突变:在操纵子中上游的基因发生无义突变、移码或插入突变不仅影响该基因的活性,也使下游基因的产物减少或改变。

 

②造成插入位点靶DNA的少量碱基对重复

IS1、Tn10:造成9bp的重复;IS3:造成3或4bp的重复。IS4:造成11bp的重复。

③转座产生新的基因

转座子带有抗性基因,如抗药性基因ampc。可产生两方面效应:基因的插入突变;出现抗药基因。

 

④转座产生的染色体畸变

在一个染色体上甚至不同染色体上若有同一个转座子的两个拷贝,通过某种方式的重组后会引起倒位或缺失。

⑤切除效应

转座子从原来位置上消失。

准确切除:使原插入发生恢复突变。

不准确切除:留下转座子残迹,产生插入突变,但转座子标志消失。

 

4.4.3.2 转座子效应的意义

①可使原来距离较远的基因组合在一起形成一个操纵子。

②将原来两段分离的DNA序列连接在一起组成一个新蛋白的基因。

③启动子部位的插入,使基因打开或关闭。

 

④细胞中存在平衡转座过程的途径,避免转座频率过高对细胞的影响。

⑤转座基因插入时,大多数受体基因被钝化;但也有被活化的基因;转座子有自己的启动子,在转录转座酶时,其它相邻基因可被转录。

 

4.4.4 转座频率的调控

转座频率的调控对细胞非常重要。一个转座子为了存活必须能维持一定的最低运动频率;如果频率过高可能对宿主细胞有害。每个转座子似乎都有调控其转座频率的机制。

 

例如Tn10的调控机制。Tn10是一个复合转座子,其中在10R插入序列的外边界处有两个启动子。启动子PIN负责10R插入序列的转录。启动子POUT使转录进行到邻近的旁侧DNA。转录通常在转座子内终止,但偶尔也会进入宿主DNA;有时这种通读转座负责激活邻近的细菌基因。

 

 

IN/OUT RNA配对抑制转座酶合成

“多拷贝抑制”现象表明:IS10R转座酶的表达是受到调控的。当IS10R多份拷贝通过一个多拷贝质粒被引入时细菌,细菌染色体上的Tn10元件的转座作用将减弱。抑制作用需要POUT启动子,并在翻译水平进行调控。

 

其作用基础是PIN和POUT间转录物5’末端区域内的重叠部分。OUT RNA是含有69nt的转录物。由于POUT是PIN更强的启动子,OUT RNA以大于100×IN RNA水平存在,并且OUT RNA比IN RNA更稳定。

 

OUT RNA作为一个反义RNA行使功能。OUT RNA在单拷贝情况下没有作用,但当拷贝数>5时有显著作用。通常每个IS10拷贝对应~5拷贝的RNA(在典型的多拷贝情况下对应~150个OUT RNA拷贝),OUT RNA与IN RNA配对;多余的OUT RNA确保在核糖体能够结合IN RNA之前与之快速结合,所以配对的IN RNA不能被翻译。

 

转座酶蛋白的量常常是一个重要特征。Tn10的转座酶以在每代中每个细胞0.15分子的低水平合成。

转座酶的偏爱性

在IS10R的一条链中有一个连续的阅读框编码转座酶。转座酶的水平限制了转座的速度。转座酶很偏爱顺式作用;即只有转录并翻译这种酶的DNA模板链存在时,它才会有效地发挥作用。顺式倾向性是由插入序列元件编码的转座酶的普遍特征。

 

对顺式倾向性的解释有两种:一是在蛋白质合成后(甚至在合成期间)转座酶和DNA紧密连接以至于转座酶不太可能分散到别处。二是这种酶未与DNA结合时,可能不稳定,因此未与DNA很快结合的蛋白质分子就不会有活性。

顺式倾向性和多拷贝抑制确保细菌基因中的Tn10拷贝数增加,而不会增加转座频率。

 

甲基化作用对转座的控制

Dam甲基化作用为单个元件提供了最重要的调控系统。它降低了转座频率,特别是降低双转座(Couple transposition)通过复制叉的频率。

IS10转座的能力与复制周期相关,通过这种周期转座子对两个位点的甲基化状态作出反应。一个位点在IS10R末端的反向重复序列内部,它是转座酶结合位点。另一个位点在PIN启动子内部,是转座酶基因转录起点。

 

这两个位点被dam系统甲基化。Dam甲基化酶修饰由复制产生的一条新合成的链上的GATC序列内的A。在Dam-菌株中两个靶位点缺少甲基化基团,所以Tn10转座的频率提高了1000倍。

复制叉在这些位点通过产生半甲基化序列;从PIN启动子更频繁的转录转座酶基因和加强转座酶与IS10R末端连接的双重作用可激活转座子。在野生型细菌中,这个位点在复制后的短期内保持半甲基化状态。

 

因此转座一般发生在复制后的短时期内,由于Tn10的非复制型机制可能会破坏供体DNA,复制产生了供体的第二份拷贝,这对提高细胞的存活机会很重要。

 

终止子和mRNA二级结构对转座酶表达的调控

转座子是随机选择其靶位点的,因此它很可能与一个有活性的操纵子结合,从外部转录转座酶基因。Tn10通过IS10R终止子的转录可降低转座酶基因的表达。同时,由于从启动子上游形成的mRNA存在一个二级结构使它很少被翻译。

 

Tn10转座频率的限制:控制转座酶的合成或功能;DNA复制后的甲基化控制;转座酶对顺式序列的偏好;RNA的IN/OUT配对抑制转座酶合成。

 

4.4.5真核生物中的转座子

转座子不仅存在于原核生物中,也存在于真核生物中。

 

4.4.5.1 玉米中的控制因子

McClintock在1940~50年间首先观察了玉米中转座因子。她研究的性状之一是玉米胚乳上的色素。当时已知很多基因共同控制红色花青素的合成,使玉米胚乳呈紫色。这些基因中任何一对基因发生突变都会影响色素的合成,使胚乳呈白色。

 

McClintock研究了玉米胚乳的紫色、白色以及白色背景上带有紫色斑点这些表型的相互关系。她根据自己的遗传学和细胞学研究推断“花斑”这种表型并不是由常规的突变产生的,而是由于一种控制因子(转座因子)的存在所导致的。

若玉米带有野生型C基因,则胚乳呈紫色,C基因的突变阻断了紫色素的合成,那么胚乳呈白色。

 

在胚乳发育的过程中,突变发生回复导致斑点的产生。回复突变发生在早期发育阶段,紫斑就比较大。

C突变是由一个解离因子(dissociator, Ds)引起的,它可插入到C基因中(即转座)。另一个可移动的控制因子是激活因子(activator,Ac),它的存在可激活Ds转座,进入C基因或其他基因,也能使Ds从基因中转出,使突变基因产生“回复突变”,这就是Ac-Ds系统。 

 

Ds存在于玉米9号染色体的一条臂上(带有结节),Ac/Ds发生的转座是通过非复制机制,并且伴随着它们从供体位置的消失。受体位点常在供体所在的同一条染色体上,而且靠得很近。Ds的转座可导致染色体断裂,当Ds存在时,有时其隐性基因可得到表达,表明其显性等位基发生了缺失所致。

 

控制成分的断裂导致了无着丝粒片段的丢失,若丢失的片段上带有杂合子的显性标记(如颜色等),结果将改变表型。

 

Ds处的断裂会形成两个异常染色体。这是由复制产物断裂末端的连接造成的。形成U形的无着丝粒和双着丝粒染色体。双着丝粒染色体导致了断裂-融合-桥循环。

双着丝粒染色体在有丝分裂过程中每个着丝粒都向相反极移动。染色体在两着丝粒之间随机断裂。

断裂-融合-桥循环持续到更多的细胞后代。

 

玉米中控制元件家族

McClintock还发现了其他系统,这些元件的成员、类型和位置在各玉米品系中都是特异的。每个家族的成员可分为两类:

①自主性元件(autonomous elements)有切离和转座的能力。由于自主元件的持续活性,它们可以插入到任何位点,产生一个不稳定的或“可突变”(mutable)等位基因。自主元件本身的丢失就使可变的等位基因变成稳定的等位基因。

 

②非自主性元件(nonautonomous elements)是稳定的,自己不能转座。当同一家族中的自主性元件存在于基因组中时,不论这自主元件位于何处都能使非自主元件具备转座功能。

同一家族的自主性元件能为非自主性元件的转座提供反式作用因子(转座酶),而不同家族间无此反应。

 

控制元件家族是通过自主元件与非自主元件的相互作用来划分的。一个家族由单个类型的自主元件组成,这些元件由各种非自主元件相伴随。一个非自主性元件根据它被什么自主元件反式激活就将它划规这种自主元件的相关家族。

 

玉米转座子的结构特点和原核的相似。在其两端有反向重复序列(IR),在与靶DNA连接处有短的正向重复(DR)。

在Ds-Ac系统中,大部分自主元件Ac的长度有2.5kb,由含5个外显子的单个基因组成,其产物是转座酶,其末端有11bp的IR,在其靶DNA位点复制形成8bp的DR。

 

各种Ds元件的长度和序列都不相同,末端同Ac一样都有11bp的IR。Ds是Ac转座子的缺失突变体,缺失的长度不同。Ds9仅缺失194bp,Ds6缺失2.5kb,长仅有2Kb,相当于Ac两端各1kb。另一个极端的例子是Ds1家族,它们只与Ac两翼11bp的IR同源,暗示转座酶可能只识别末端的IR。或包括一小部分内源序列。

 

非自主元件的来源

非自主元件是来自于失去了反式作用功能的自主元件,自主元件通过缺失或其他的变化,使得失去了反式作用的转座酶活性,但留下了完整的转座酶作用位点和边界。

 

自主元件可以通过DNA序列变化或者经过化学修饰变成非自主元件。同样,非自主元件也可能进一步发生改变。

顺式作用的缺陷可能使非自主元件不受自主元件的影响。这样一个非自主元件可能成为永远稳定的,它变得不再为转座子所激活。

 

自主元件的相变

自主元件的“相变”(changes of phase)可影响转座的时间和频率。“相变”是这些自主元件以可逆失活的形式在有活性和失活之间循环。自主元件的相变可由DNA甲基化等作用产生。

 

转座的自我调节控制

在基因组中Ac元件数量的增加会减少转座频率。Ac元件可能编码转座的抑制物;具有转座功能的某些蛋白可能带有这种活性(如同Tn10)。

 

玉米的Spm和En转座子

Spm和En自主元件仅有不到10nt的差异,属于同一个家族。末端含有13bp的IR,在靶DNA位点重复形成3bp的DR。Spm和En的转录区有8.3kb,转录物中含11个外显子接成2.5kb mRNA,编码621个氨基酸的蛋白,这个基因称为tnpA,TnpA蛋白结合在转座子末端区域的多拷贝(12bp)保守序列中的一个拷贝上。TnpA可能是切除作用所必需的。

 

在tnpA的第一个内含子中还有另外两个开放阅读框(ORF1和ORF2),它们包含在一个可变剪接的6000b的RNA中,这种RNA的含量占tnpA mRNA的1%。含有ORF1和ORF2的功能性基因称为tnpB。它产生的蛋白可能结合13bp的IR上,剪切末端进行转座。

 

这个家族所有的非自主元件(dSpm是缺陷的Spm)都和Spm元件本身的结构密切相关。它们是tnpA缺失了外显子。

如果缺失突变发生在内含子1对应的区域,破坏了TnpB,则可诱导较弱的转座,例如Spm-w。表明在转座中TnpB的功能可以被部分地取代。

 

4.4.5.2 果蝇中的转座子

黑腹果蝇的一些品系在杂交时遇到了困难。当其中两个品系的果蝇杂交时,子代表现“败育性状”,产生一系列的缺陷,包括突变、染色体畸变、减数分裂不正常分离以及不育。这些相关的缺陷的出现称为“杂种败育(Hybrid dysgenesis)”。

 

黑腹果蝇中有两个与杂种败育有关的系统已被鉴定。

第一系统,果蝇被分为I型(inducer,诱导型)和R型(reactive,反应型)。I型雄蝇与R型雌蝇杂交将降低生育能力,但反交相反。

第二系统,果蝇分为P型(Paternal contributing,父系贡献型)和M型(Maternal contributing,母系贡献型)。P型雄蝇与M型雌蝇杂交获得不育型,但反交可育。

 

P转座子引起杂交不育

在P-M系统的杂交中,F1代果蝇有正常体细胞组织,但性腺不发育。

 

在与M雌蝇杂交中P型雄蝇的任何一条染色体都能导致不育。重组染色体的结构表明,在每条P型雄蝇染色体中的各区域也都导致不育。这表明P型雄蝇具有大量的P元件,P元件存在于很多不同的染色体位置上。而在M雌蝇的染色体上都没有P元件。

 

通过对杂种不育果蝇的w突变体的DNA作图发现,所有突变都是由于DNA在w座位插入P元件引起的。

P的插入形成了一种可转座系统。各个P元件长度不同,但序列同源。所有的P元件末端都具有31bp的IR,而且使靶序列产生8个bp的DR。最长的P元件约2.9kb,有4个外显子。短一些的P元件是由全长序列缺失产生的。至少一些短的P元件缺失转座酶基因,但可被完整P元件编码的酶反式激活。

 

一个P品系果蝇带有30~50拷贝的P元件,其中约1/3具有完整的结构。在一个P品系中,这些元件是作为基因组中没有作用的成份。但当一个P雄果蝇和M雌性杂交时它们被激活转座。

来自P-M杂种不育果蝇的染色体中P元件插入到很多新的位点。典型的杂种不育果蝇染色体在热点(对P元件敏感位点)发生断裂。P元件对M染色体的平均转座率约是每代一次。

 

P转座子的基因表达

P元件初始转录物有2.5kb或3.0kb两种不同的长度。

在不同组织中P元件可产生两种蛋白:①在体细胞中,仅前2个内含子被剪接,产生了外显子0、1和2编码区,翻译成66KD的蛋白,它是转座激活的阻遏物。②在生殖系统中,4个外显子全部拼接在一起形成mRNA,它翻译产生一个87KD的转座酶。

 

两种类型的表达表明了第3个内含子的剪接对转座是必要的。①若突变内含子3的末端序列,P元件则失活;②若第3个内含子缺失。外显子3在各组织中都会组入到mRNA中,那么体细胞也和生殖一样发生转座。

体细胞中含有一种蛋白,它结合在第3个外显子上,阻止这个内含子的剪接。在生殖细胞中缺乏这个蛋白,因此可以剪接第三个内含子产生编码转座酶的mRNA。

 

P元件的转座需150bp左右的末端DNA。转座酶结合在10bp的序列,这序列和31bp的IR邻接,通过非复制型机制转座。

 

细胞质因子对转座的影响

杂种不育的性别依赖表明细胞质和P元件同样重要。细胞质因子的作用被称为细胞型(cytotype);在含有P元件的品系中有P细胞型,而缺少P元件品系具有M细胞型。杂种不育仅发生含有P元件的染色体进入M细胞型时,即雄性亲本有P元件,而雌性亲本却没有P元件的情况。

细胞型表明一个可遗传的细胞质因子。当母体为P细胞型,父本为M细胞型时,它们的杂交后代是可育的。

 

细胞型的作用取决于66KD蛋白抑制转座的能力。这个蛋白质是卵中母系因子。在P品系中必须要有足够的蛋白来抑制转座的发生。含有P元件的雌果蝇与无论是否带有P元件的雄果蝇杂交,由于P细胞型的存在抑制了转座酶的合成或激活。

 

但当雌果蝇为M型时,在卵中无阻遏物,这样导致了来自雄果蝇中的P元件使生殖细胞中转座酶活化。

 

P细胞型能对多代后代发挥作用,表明卵中必须要有足够的阻遏蛋白,而且也要相当稳定,通过成体传递到下一代的卵中。

 

4.4.6 反转录转座子

4.4.6.1 逆转录病毒

逆转录病毒(retroviruses)的基因组是单链的RNA,它被逆转录成双链DNA中间体复制,双链DNA通过类似转座的机制被插入到宿主基因组中。它们的转座是通过RNA介导的。因此称之为反转录子(retroposons)或反转录转座子(retrotransposons)。

 

被整合到细胞基因组中的逆转录病毒序列称为原病毒(Provirus),一个原病毒就作为细胞基因组的一部分。有时细胞的序列能与逆转录病毒的序列重组并且随之转座,这些序列可能以双螺旋形式插入到基因组的新位点。被逆转录病毒转座的细胞序列能改变被感染细胞的特性。

 

逆转录酶在宿主细胞中将RNA逆转录成双链DNA(DNA也能被逆转录成环形的,但环形DNA不能进行复制)。线形DNA进入到细胞核中,一个或多个DNA分子在整合酶(Integrase)催化下被整合到宿主基因组中,整合的原病毒被宿主的转录系统转录为病毒RNA,这个RNA既能充当mRNA也能作为基因组被包装成为病毒。整合作为病毒生命周期的一部分是转录所必需的。逆转录酶和整合酶是由病毒基因组编码的。

 

gag编码核心蛋白,pol编码逆转录酶和整合酶,env编码外壳蛋白

 

病毒的RNA在末端有同向重复序列(Direct repeat),紧挨5’端的是80~100nt的U5区。在3’端前是170~1350nt的U3区。DR片段在将RNA逆转录为DNA时被用来产生大量的同向重复序列,这些重复序列能在线形DNA找到,在整合的形式DNA中两端各缺少2bp,是由整合的机制造成的。

 

整合原病毒的形式是线形DNA,DNA两端序列都是“U3-R-U5”,称为LTR(long terminal repeat,长的末端重复序列)。

并且,U5的3′端和U3的5′端由一个短的IR组成,因此LTR本身的两个末端都有反向重复序列。

 

整合的原病毒DNA与转座子(Transposon)类似,原病毒末端有短反向重复序列,其两端有靶DNA的正向重复序列。

原病毒是有直接将其线形DNA序列插入靶位点产生。与转座子情况类似,病毒DNA的末端很重要,末端突变能阻止其整合。

 

最保守的特点是紧靠反向重复处存在二核苷酸CA。整合酶把线形DNA末端与一个核糖核蛋白质复合物结合,并切除保守CA以后的碱基,把平末端转变成凹末端。

靶位点是随机在序列上选择的,整合酶在靶位点上交错切口,靶DNA被切除的5’端和病毒DNA的3’凹陷末端共价连接。病毒DNA一条链的两个末端先被连到靶DNA上,随后单链区被宿主的酶所修复。

 

在此过程中,病毒DNA 5’端的两个突出碱基被去除。结果使被整合的病毒DNA在每个LTR序列上丢失两个碱基,这就是5’U3左端和3’U5右端丢失2bp的机制。

在被整合的逆转录病毒基因组每个末端都存在一个靶DNA的特征短同向重复序列。

 

每个LTR的U3区携带一个启动子。左边LTR的启动子负责起始转录原病毒。启动子实际上是由RNA到双链DNA转化所形成的。

 

4.4.6.2 酵母的Ty元件

Ty(transponson yeast,酵母转座子)是由分散的DNA重复序列家族组成,在不同品系的酵母中它们所处的位点不同。

转座后在插入的Ty两端靶基因产生5bp正向重复。Ty的转座效率为10-7~10-8,低于细菌转座子。

在不同Ty元件之间有很大的不同。大部分元件属于两个大家族。被称为Ty1和Ty917。

 

每个元件长6.3kb,其末端是330bp同向重复序列,称为δ。各种类型中的每个Ty元件都有一定的差异,包括碱基对的替代、插入和缺失。在一个典型的酵母基因组中有约30个拷贝的Ty1型和约6个Ty917型元件。另外还有约100个独立的δ元件,称为单独δs。

 

Ty元件可被转录成2种带有poly(A)+的RNA,其含量占单倍酵母细胞总mRNA的5%以上。这两种RNA的转录都是在左边δ元件内的启动子中起始,一个在5kb之后终止;另一个在5.7kb后终止,终止子位于右端的δ序列内。

 

Ty序列有两个同向的开放阅读框,这两个阅读框有13个氨基酸的重叠。TyA序列编码一个DNA结合蛋白质。TyB含有与逆转录病毒的逆转录酶、蛋白酶和整合酶基因同源的序列。

 

TyA和TyB的结构和功能与逆转录病毒的gag和pol相似。

TyA和TyB是在两种阅读框中表达。TyA蛋白由TyA读框编码,在其末端终止。但TyB读框仅表达成为连接蛋白的一部分。通过特殊的移码通读终止密码,将TyA区域和TyB区域融合在一起。

 

Ty元件的重组似乎是爆发式发生,当一个发生重组会引起一系列重组。在Ty元件之间的基因改变发生在不同的位点,结果导致一个元件被另一个取代。

Ty元件提供了一个较小的同源区。此同源区也就是由宿主系统介导的重组事件的靶子。这种重组常导致染色体的损伤。当重组发生在同一条染色体上的两个Ty元件之间时,会导致缺失或倒位;当重组发生在不同染色体上的Ty元件之间时会导致更为剧烈的改变。

 

在同向重复的δ序列之间的重组能导致Ty元件被删除,存在大量单独的δ就是这些事件的印迹。

 

两个δ元件具有相同的序列,但却表现出对立的结果,在一端δ序列的启动子表现活性,而另一端的δ序列的终止子表现活性。相似的特点发现在其他的转座因子中,包括反转录病毒。

Ty元件是典型的转座子,需要通过RNA中间体进行转座。

 

检测Ty元件转座的方法是将一个内含子插入Ty元件中,并将一端的δ通过碱基取代进行标记。此序列由质粒上的Gal启动子来控制,然后导入到酵母细胞中,转座的结果酵母的基因组中存在多个拷贝的转座子,但都没有内含子。

 

RNA剪接可除去内含子,说明转座是以逆转录病毒相同的机制进行的。Ty元件转录成为能被剪接复合体识别的RNA。剪接后RNA又能被逆转录酶识别,然后产生双链的DNA拷贝。

 

Ty元件与反转录病毒的相似之处:

①原来的Ty元件两端的δ序列是不同的,但转座后的Ty两端具有相同的δ序列,如同LTR。

②转座是由Ty元件内的基因控制的。Gal启动子用来控制被标记的Ty元件的转录,这个启动子可通过加入Gal来诱导打开。启动子的诱导可促进被标Ty元件的转座。

 

③虽然Ty元件不产生感染颗粒,但在经诱导发生转座的细胞中存在着Ty病毒样颗粒(VLP, virus-like particles)。它们含有全长的RNA、双链DNA、TyB产物、TyA的产物像gag的前体一样被剪切产生VLP成熟核心蛋白质。这使Ty转座子和逆转录病毒很相似。

 

④仅有某些Ty元件在任何酵母基因组中都有活性;大部分没有转座能力,这和惰性的内源性前病毒相似。由于这些无活性的Ty元件保留了δ重复序列,这些序列在对活性Ty元件的产物作出反应过程中提供了转座的靶序列。

 

4.4.6.3 果蝇中的反转录子

果蝇中存在有与E.coli插入序列相似的情况,推断果蝇可能存在转座因子。通过缺失可使一些不稳定的突变恢复为野生型,或者在原来突变位点两侧的DNA发生缺失而得以回复。这可能是由各种类型转座因子所致,其中包括copia反转录子,末知类型的FB家族和已介绍的P元件。

 

Copia元件

copia是反座子研究最多的一个家族。它的名子反映了存在大量密切相关的编码高丰度mRNAs的序列。copia家族是作为各种其他类型元件的一个范例,这些元件并不相关,但结构和行为相似。

copia的拷贝数是由果蝇的品系决定的,通常是20~60个拷贝。这个家族数量巨大,分布广泛。在不同品系的果蝇中copia所在的位置不同。这种差异是在长期进化中形成的。

 

copia元件长约5kb,末端带有276bp的正向重复。正向重复序列本身的两端又有反向重复。在插入位点产生一个5bp的正向重复序列。

每个copia两端的正向重复序列都是相同的,表明在相关的过程中它们可能相互作用,或者二者都是在转座中由一祖先元件的一个正向重复序列产生的。和Ty元件相似,表明与反转录病毒的关系。

 

copia序列含有一个长4227bp的阅读框,阅读框的一部分与反转录病毒的gag和pol同源。但阅读框中没有与反转录病毒的env序列同源的部分,表明copia和Ty一样不能产生病毒样颗粒。

copia的转录本是高丰度poly(A) mRNA,它有完整长度的转录本和部分长度的转录本两种形式,它们是在一个末端重复序列的中部起始转录的,因此有相同的5’端。

 

虽然还缺乏copia产生转座的直接证据。但copia有很多与反转录病毒结构相似之处,看来copia必定有一个与反转录病毒相关的起源。现在很难说明它具有多少反转录病毒的功能。当然现在知道它可以转座,但(和Ty元件的情况相似)没有证据表明它们有感染能力。

 

FB元件

黑腹果蝇中另一个转座因子家族的成员是FB(foldback,折回),它具有长度不同的反向末端重复序列。有的FB元件仅由两个紧密相连的反向重复所构成。而另一些两端是反向重复序列,中间有非重复的DNA区域所构成。所有FB家族成员虽然其反向重复序列长短各异,但都是同源的。

 

现在还不知道FB元件转座的能力的来源。有时两个不相同的FB元件可以协同转座一个大片段间插DNA序列。可能以细菌转座子相似的方式转座。也可能是通过两个末端的FB元件使任何DNA序列折叠成一个单位进行转座。

 

普遍性转导是Lederberg和他的学生Zinder在1951年研究鼠伤寒沙门氏菌时发现的,发现这种菌中存在一种滤过性因子,能转移细菌的迁何基因,后来证明这种滤过性因子是温和性噬菌体P22,由于P22能转导任一基因,所以称普遍性转导。P1噬菌体也能进行普遍性转导。

P1和P22能转导任一基因的原因是因为P1是在细胞质中溶源。P1转导型噬菌体的形成是由于错误包装。当诱导P1溶原菌时,P1噬菌体在宿主中复制,将宿主染色体打成片段,包装时将与P1基因组大小一致的染色体片段包入P1头部就形成转导型噬菌体。为了证明这一点,将thy-菌分别在胸腺嘧啶和5-溴脱氧尿嘧啶的培养基中培养。共三份:A中加胸腺嘧啶,B和C中加5-溴脱氧尿嘧啶,培养后用P1去感染,其中B份中P1感染时转入胸腺嘧啶中培养,将裂解液密度梯度离心分部收集噬菌体,并分析各级分中有侵染力的和有转导作用的P1颗粒。发现B份中有侵染力的P1密度与A份中的相同,而有转导能力的P1的密度与C份中的相同,充分证明了转导型P1包装的是宿主的DNA。

 

局限性转导最早由Lederberg发现,他用紫外光照射野生型大肠杆菌E. coli(λ),得到的裂解液再去感染E. coli  K12的各种非溶源的突变株.发现只有gal-突变株有10-6的几率被转导成了gal+,其他突变体均不被转导成野生型,说明λ噬菌体只转导供体菌染色体上特定基因,所以叫专一性转导。

λ噬菌体整合位点附近刚好是gal基因,整合的λ噬菌体可从染色体上割离下来,割离可以是正常的也可以是错误的,错误割离的几率是10-6,错误割离后产生带有一段染色体基因(如gal)同时缺失了λ本身一部分基因的λ噬菌体的基因组;这种由于错误割离产生的λ噬菌体就是转导型噬菌体(λdg)。用这种方法得到的λ裂解液转导频率很低(10-6)。如果用λdg和λ同时感染E. coli K12,可到双重溶源菌λdg/λ。

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