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5.2 原核生物RNA合成
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:8803    更新时间:2011/4/15
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5.2.1 RNA聚合酶

5.2.2 启动子

5.2.3 转录过程

5.2.4 转录后的加工

5.2.5 σ因子的替换

 

5.2.1 原核生物RNA聚合酶

①RNA聚合酶的特性

细胞均具有RNA聚合酶,E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子。它催化RNA主链中核苷酸间的3’,5’磷酸二酯键的形成,在37℃时RNA链的延伸速度可达40nt/s(翻译速率15密码子/s,复制速率800bp/S)。

RNA的合成必须有DNA模板存在,并且要非常精确。转录作用并没有校正(proofreading)机制。

 

②原核生物RNA聚合酶的组成

原核生物的RNA聚合酶是由ββ’α2ws等亚基和2个Zn2+构成的全酶(Holoenzyme)。呈椭圆球形结构,全酶可结合约60bp的DNA序列。

 

原核生物中,a、b、b’亚基的大小比较恒定;亚基变动较大,分子量32kD~90kD,对转录不同的基因RNA pol选择不同的亚基。

 

③原核生物RNA聚合酶各亚基的功能

β和β’共同组成了酶的催化中心。它们的序列与真核生物RNA聚合酶的最大亚基相关。

β亚基可能是酶和核苷酸底物结合的部位。

利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)可与β亚基结合,阻止RNA链的延伸(而不影响起始,它使聚合酶停留在启动子处),从而抑制转录的发生。

 

β亚基的基因rpoB的突变可使细菌对利福平有抗性。

 

β’亚基是酶与DNA模板结合的主要成分。

肝素是一种多价阴子,能与β’亚基结合。因此,肝素能与DNA竞争与RNA聚合酶相结合,从而在体外抑制转录作用。可见β’亚基有较强的碱性,可与模板DNA相结合。

 

α亚基的功能可能是识别其相应的启动子。

当T4噬菌体感染E. coli时,其α亚基的精氨酸残基上被ADP-核糖化,修饰作用使RNA聚合酶全酶对其识别的启动子亲和力减弱。所以认为α亚基的功能可能是识别其相应的启动子。

 

s因子的作用

原核生物s因子的功能:帮助核心酶辨认启动子;解开DNA的双螺旋。

 

大肠杆菌有不同的s因子分别转录不同类型的基因,这在基因表达调控中有重要作用。

s70转录大部分基因;s32转录热休克蛋白基因;s28转录与运动相关基因;ss转录与抵抗外来压力相关基因;s54转录与氮利用相关基因等。

 

全酶上s亚基结合不牢固,当s亚基脱离后,ββ’α2称为核心酶。核心酶可催化核苷酸间磷酸二酯键的形成。

 

④原核生物RNA聚合酶基因

E. coli RNA pol各亚基的基因存在于3个操纵子中。

 

细菌的RNA聚合酶远比某些噬菌体特有的RNA聚合酶结构大且复杂,仅由一条肽链组成的噬菌体RNA聚合酶只能识别噬菌体DNA所有的少数几个启动子,而不能识别其他启动子。

例如噬菌体T3和T7的RNA聚合酶分子很相似,都是一条多肽链,MW约11kD。它们在37℃时合成RNA速率可达200nts/s。

 

宿主细胞RNA聚合酶能转录细胞内的任意一个转录单位。这些转录单位中有一些可由RNA聚合酶直接转录,不需要其他因子的帮助。但大多数转录单位需要更多的蛋白质因子存在下才能被RNA聚合酶所转录。所以宿主细胞具有大而复杂的RNA聚合酶在与许多其他因子相互作用中起主要作用,而不是其催化活性的要求。

 

RNA pol在体内和体外都是经过4步反应聚集而成。酶的三个亚基(α、β、β’)都参与了和σ亚基的结合。

2α→α2

α2+β→α2β

α2β+β’→α2ββ’(核心酶)

α2ββ’+σ→α2ββ’σ(全酶)

 

5.2.2 启动子(Promoter)

转录时RNA聚合酶在DNA分子上与启动子识别和结合。启动子是由一些短的保守序列组成的。

启动子是DNA上可与RNA聚合酶特异结合并起始转录的部位(序列),位于转录起点附近。

启动子可位于上游,也可在下游(个别)。

 

5.2.2.1 启动子的分离

用足迹法可鉴定并分离出启动子(或其它蛋白),启动子处的核苷酸顺序具有特异性可结合RNA聚合酶。

Footprinting: a technique derived from principles used in DNA sequencing, is used to identify the specific DNA sequences that are bound by a particular protein.

 

当DNA被RNA pol结合时,其覆盖部分不被DNase水解,因此会被部分消化。

适当条件下每个DNA分子中未与蛋白质结合部分的每个磷酸二酯键都被切割一次,切割位置可通过DNA一条链的末端标记来识别。

 

对末端标记分子在敏感位点进行部分剪切会产生一个特殊长度的片段。

通过凝胶电泳根据长度不同进行分离,具有标记末端的片段产生一条标记条带,条带的位置与该片段的碱基数相一致。最短的片段移动最快。

 

对于游离DNA每个敏感键都会被破坏,产生一系列条带,每个条带的位置代表一种碱基,因此,根据游离DNA的对照实验可以知道RNA聚合酶在启动子上结合的位置和序列。

 

通过足迹法修饰技术可找到RNA聚合酶与启动子的接触位点,用修饰特定碱基的试剂处理RNA聚合酶与DNA的复合体,并将其与游离DNA以及未被修饰的复合物相比较。可以显示被聚合酶保护的位点不被修饰,而有些位点更易修饰,说明这些位点DNA更加暴露。

如果先修饰DNA再将其与RNA聚合酶结合,这样就可以确定与聚合酶结合的位点。

 

结果显示启动子的-35区和-10区包含了与聚合酶接触的大多数位点。这些位点经修饰后可阻止与聚合酶结合,并且这些位点在结合聚合酶后对修饰的敏感性增加或降低。尽管突变实验表明接触点与突变位点并不完全一致,但它们出现在相同的某个区域内。

 

虽然不同启动子相同位点上的碱基不同,但聚合酶与它们的接触位点相同。这表明聚合酶与启动子的结合反应并不依赖于接触点上的特定碱基。这也解释了为何一些接触点并非突变点,而且不是每个突变都在接触点之内,突变点可能通过影响邻近碱基而并不与酶接触。

 

5.2.2.2 Promoter的结构

比较原核生物的100多个启动子的序列后发现:在RNA转录起始点上游大约-10bp和-35bp处有两个共同的顺序,称为-10和-35序列。

-10区:5’-T80A95T45A60A50T96,称Pribnow box,RNA聚合酶就结合在此部位上。

-35区:5’-T82T84G78A65C54A45;与转录起始的辨认有关,是s亚基识别并结合的位置。-35序列在很大程度上决定了启动子的强度。

 

RNA聚合酶分子大约能覆盖70bp的DNA序列,因此酶分子上的一个适合部位就能占据从-35到-10序列区域。

①RNA聚合酶能与-35和-10区中的碱基及DNA主链中的磷酸基相接触;

②与共同顺序差别较远的启动子活性较弱;

③破坏启动子功能的突变中有75%是改变了共同顺序中的碱基,其余25%为离共同顺序较近的。保守序列以外的序列对启动有调节作用。

 

-35和-10序列相距约是两圈双螺旋的长度(约20bp),使这两个结合区在DNA分子的同一侧面,因此RNA聚合酶结合在双螺旋的一面。与每个结合区的沟底中碱基发生特异识别。

 

 

典型的启动子由-35区、-10区的共有序列和起始点(一般为CAT)三个部分组成。

当-10区和-35区中心位置相距16~18bp时,启动子的功能较强;否则,起始转录功能减弱。

 

不同启动子启动效率不同,分为强启动子(1~2sec启动1次转录)和弱启动子(>10min启动1次)。

 

尽管启动子具有保守序列,但不同类型在序列上存在差异,不同σ因子识别不同类型的启动子。有很多调节蛋白(激活剂和阻遏物,如CAP)参与识别过程。同时,启动子保守序列以外的序列,特别是上游序列对启动子的启动有影响。

 

5.2.2.3 σ因子与启动子的接触

包含不同σ因子的全酶能在-35和-10区识别一系列共有序列,暗示σ因子在这些区域和DNA接触。说明在σ因子和核心酶间有一种通用的结合关系,使得σ因子与启动子的-35区和-10区接触。

 

σ因子与启动子在-35区和-10区共有序列接触的直接证据是:σ的突变能够抑制共有序列的突变。当启动子特定位置的突变阻止了RNA聚合酶的识别时,σ因子的代偿突变允许聚合酶利用突变的启动子。

 

σ因子结构的不同区域分别参与了和编码链的接触、熔链反应以及与核心酶相互作用。

-35区作为启动子的识别域,-10区为“解链域”。

 

σ70被证明可Tyr425、Tyr430、Trp433、Trp434等四个氨基酸残基直接与启动子-10区的TATAAT序列作用,解开DNA双螺旋。

 

 

全酶形成时,s因子在核心酶表面有一个伸展的构象。

 

DNA与全酶及核心酶结合在空间位置的变化有利于DNA进入活性位点。

 

全酶中的σ因子可与启动子结合,游离的σ因子能和启动子结合吗?

σ70的N末端区部分被去除后就能与启动子序列特异地结合。表明N端为一个自我阻抑域(Autoinhibition domain)。当σ70游离时DNA结合域被封闭,与核心酶结合后构象改变而解除抑制,σ70的DNA结合域可与DNA结合。

 

核心酶可和不同的因子组成全酶,因子借助共有序列识别不同的启动子。

 

5.2.3 转录过程

5.2.3.1 RNA合成的启动

RNA合成的启动包括:RNA聚合酶与启动子的识别和结合并形成开放复合物;RNA链的第一个磷酸二酯键形成;聚合酶成功地延伸RNA链而离开启动子。

 

①RNA聚合酶对启动子的识别

σ因子控制聚合酶与DNA的结合:只有全酶才能起始转录。σ因子能够保证RNA聚合酶稳定地结合到某个特异的、唯一的启动子上。

 

核心酶对DNA有一定亲和性,其中起主要作用的是碱性蛋白与酸性核苷酸间的静电吸引。在这种结合反应中核心酶所结合的某段DNA变为疏松结合位点(Loose binding site),DNA仍然保持双螺旋结构,位于此位点的复合物是稳定的。聚合酶从DNA上解离的半衰期约为60min。核心酶不能区别启动子和其它DNA序列。

 

σ因子可使RNA聚合酶与DNA的亲和性发生很大变化。全酶识别疏松结合位点或结合其他DNA序列的能力将大大降低,这个反应的结合常数减少约104,复合物的半衰期<1sec。所以σ因子使一般的结合能力变得很不稳定。

 

但σ因子具有识别特异结合位点的能力。因此全酶可紧密结合在启动子上,结合常数比核心酶增加1000倍,半衰期达几hr。

全酶对于启动子的识别特异性为一般DNA序列的107倍,当然全酶结合到不同启动子的速率也有很大差异,这是决定某个启动子起始转录效率的重要因素。结合常数从1012~106不等,启动子的相应启动频率从约1/sec(rRNA基因的)到约1/30min(LacI启动子)。

 

RNA聚合酶在细胞中存在的可能状态

参与转录剩余的核心酶主要以闭合松弛复合体状态存在,因为它们与DNA结合很快而解离较慢。因此很少有游离核心酶存在。

 

细胞中有足够的σ因子,可供1/3的RNA聚合酶组装成全酶,并且它们分布在非特异位点的松弛复合体和位于启动子的二元复合物(多为闭合的)之间。

约有一半含核心酶的聚合酶从事转录。估计很少有游离的全酶。

 

RNA聚合酶从基因组中识别启动子的模式

随机扩散方式:RNA聚合酶以随机扩散方式移动,全酶很快与疏松结合位点结合或解离,直到随机遇到一个启动子,并与之识别,形成一个开放复合体而牢固结合。

 

由扩散决定的与一个60bp的靶位点相结合的速率常数<108M-1S-1,这是扩散的上限。这样找到启动子的时间就太长了。聚合酶与启动子结合的速率常数比随机扩散快得多。因此随机扩散是不可能的。

 

与RNA聚合酶结合的DNA序列之间迅速交换:RNA聚合酶结合到DNA后始终与之接触,结合了DNA后聚合酶将这段序列与其它序列迅速交换直至发现启动子,酶与启动子形成稳定的开放复合物起始转录。

 

结合与解离是同时进行,因此搜索过程变得很快。直接置换可以使酶“定向行进”,即酶总是优先地由结合较弱的位点移动到结合更强的位点。

 

聚合酶沿DNA滑动:酶以一维随机方式沿DNA滑动,仅当遇到启动子时才停止。但无证据证明RNA聚合酶(或其它DNA结合蛋白)是以这种方式行使功能的。

 

②转录泡的形成

当RNA聚合酶结合到启动子上时,在DNA链上形成转录泡(transcription bubble),此处DNA双螺旋被打开,其中一条作为RNA合成的模板。

 

RNA链从5’→3’方向按照碱基配对原则逐个加上核苷酸,合成中3’-OH与新加上的核苷酸5’-三磷酸基团反应形成磷酸二酯键。当RNA聚合酶沿DNA移动时,转录泡也随之移动,合成RNA链也随之增长。

 

随RNA聚合酶沿DNA模板移动在转录泡的前端解开DNA链,并在转录泡后端重新聚合成DNA双螺旋。转录泡长度12~14bp,但泡内的RNA-DNA杂交区长度较短。

 

③转录起始

全酶和启动子通过形成一个闭合二元复合物而开始反应。它们的结合是可逆的,用平衡常数(KB)描述。形成闭合复合体的平衡常数值变化范围较大。

 

与酶结合的一小段DNA序列的“熔解”导致了闭合复合体转变为开放复合体。这称为紧密结合(Tight binding)。对于强启动子闭合复合体向开放二元复合物的转变是不可逆转的,这个反应通过速度常数(K2)描述。此反应很快,σ因子参与熔链过程。

 

最开始的两个核苷酸间连接形成第一个磷酸二酯键,这样就产生了三聚体(Ternary complex),包括RNA、DNA和聚合酶。三聚体的形成通过速率常数Ki来描述,它K2要快的多。随后加入核苷酸但不发生酶的移动,直到9nt的RNA链为止。

 

任何一个核苷酸加入后,聚合酶都有释放RNA导致失败起始(Abortive initiation)的可能性,但之后聚合酶又开始合成第一个碱基。失败起始常常产生一系列短的寡核苷酸(2~9nt)。

 

当起始过程完成后,聚合酶释放出σ因子而转变为核心酶,核心酶和DNA、新生RNA组成延伸三聚体。聚合酶沿模板移动,RNA链延长超过10nt的长度。

聚合酶需要多长时间离开启动子以便其它聚合酶来重新起始。启动子的空缺时间(Clearance time)的最小值为1~2Sec,所以最大起始频率应<1次/Sec。

 

转录起始的第一个核苷酸通常是pppA或pppG,较少为pppC,但偶尔亦可为pppU。

有时转录可在好几个相邻核苷酸处起始,即RNA pol似乎是可屈伸的,它能覆盖和巡游解链区的一部分,找出一个嘌呤作为起始,而嘧啶是它的第二选择。

许多RNA在合成后经过了核酸内切酶加工,因此,从细胞内分离的RNA的5’-核苷酸不一定是起始转录的核苷酸。

 

起始转录是RNA pol与启动子的识别作用。不同启动子对RNA pol亲和力不同。强、弱启动子的差别主要在于-35区的顺序不同,同时,Pribnow与-35区间的距离也有影响。

 

5.2.3.2 RNA链的延伸

延伸(elongation)阶段包括DNA结构的改变引起的转录泡移动。在转录中,模板链的瞬间解旋区与新生的RNA链在生长点互补配对。

 

延伸过程中聚合酶沿DNA移动,不断合成RNA链,随着聚合酶的迁移使DNA解旋,逐渐暴露出新的单链模板。

 

核苷酸以共价键形式被添加到RNA链的3’末端,在解旋区形成一个RNA-DNA杂交链。解旋区之后的DNA模板链又和编码链重新形成双螺旋。RNA形成游离的单链。

 

RNA聚合酶是沿着DNA链3’→5’方向移动。因此RNA链的合成方向也是5’→3’。

 

启动和延伸要求聚合酶改变与启动子的结合力

RNA聚合酶在转录启动过程需要与启动子牢固结合,而延伸过程则要求与聚合酶与转录过程中所遇到的所有序列紧密结合。σ因子与核心酶的可逆结合可以解决这个问题。

 

转录起始后σ因子或者被释放出来,或者改变与核心酶的结合而不与DNA结合。由于σ因子数量少于核心酶,因此,游离的σ因子可循环利用。

 

释放了σ因子的核心酶会与DNA非常牢固地结合,它基本上被“锁定”在链上,直到延伸完成。转录终止时,核心酶被释放,然后恢复与DNA上疏松位点的结合。如果丢失了σ因子,核心酶必需找到另一个σ因子才能开始下一轮转录。

 

核心酶本身对DNA就有很高的亲和性,当新生RNA存在时,这种亲和性增加。但由于它对疏松结合位点的亲和性太高,以至使其不能将启动子与其它序列辨别开。

 

σ因子通过降低疏松复合物的稳定性,使它与启动子的辨别过程更快发生。σ因子还通过稳定与牢固结合位点的结合使反应不可逆地形成开放复合体。当核心酶释放σ因子(或改变结合力)时,它恢复了对DNA的一般亲和性,即对所有序列一视同仁,这很有利于转录的继续。

 

σ因子释放的必要性

σ因子的主要功能是启动,RNA链合成达8~9nt时,σ因子被释放(或改变结合力),否则将造成核心酶与启动子结合过紧而不能沿模板移动。

 

起始和延伸过程中聚合酶形状有很大变化

当RNA聚合酶结合到DNA上时,酶蛋白质空间结构的延伸是沿着DNA进行的,但随着转录过程的进行其形态大小也发生着变化。

 

RNA聚合酶全酶最初结合到DNA上时,它覆盖了从-55到+20大约75~80bp的长度。然而处于伸展状态的RNA聚合酶(长轴16nm)仅可覆盖约50bp的DNA,表明当聚合酶覆盖更多碱基时,DNA在某位置上发生了弯曲。

 

RNA合成由起始到延伸转变过程中聚合酶不再与-55到-35区域结合,仅有约60bp的DNA被聚合酶覆盖。表明启动子的上游部分仅参与RNA聚合酶的起始识别,而不参与起始晚期的过程。

 

当RNA链延伸到15~20nt时,酶形态发生进一步变化,转变成负责转录延伸的复合体,覆盖30~40bp长度。

 

解链和螺旋同时进行

RNA聚合酶在延伸RNA链的同时使转录泡前端解链,后端重新形成DNA双螺旋,生长的RNA链前端与模板链有较短的RNA-DNA杂交区。在RNA链离开模板时,此杂交区即复原,同时两条DNA链即又重复螺旋化。

 

转录过程不断产生超螺旋

转录时在聚合酶的前端产生正超螺旋,后端形成负超螺旋。拓扑异构酶可消除超螺旋。

 

转录速度并不恒定,在富含GC区转录速度减慢或暂停(pause),若将富含GC区突变为富含AT区,则暂停消除。

 

被停止的RNA聚合酶可以重新开始。

 

5.2.3.3 RNA合成的终止

每个基因或操纵子都有一个启动子和一个终止子(terminator)。终止子是转录终止所需的DNA序列。

在RNA聚合酶转录过程中遇到终止子时,酶停止向正在生长的RNA链添加核苷酸,RNA-DNA杂交区域解链,从DNA模板上释放RNA产物,DNA重新形成双螺旋。

 

由于RNA的3’端在细胞中可能已经通过初始转录物的剪切加工,因此很难确定RNA分子的终止位点。如果用RNA聚合酶体外终止实验得到的终止位点与体内产生相同末端时就能确定真正的3’端。

 

终止子的作用是在DNA模板的特异位点处终止RNA的合成。然而产生终止作用的是聚合酶转录出的RNA形成的发夹结构。表明终止依赖于RNA产物,而不是由转录中DNA序列来决定。

 

原核生物的转录终止子有两种:

不依赖于蛋白质因子而实现的终止作用,核心酶本身即可终止转录;

依赖蛋白质辅因子(称为释放因子,即ρ因子)才能实现终止作用。

两类终止子的共同的序列特征是在转录终止之前都有一段回文结构,在这段互补序列之间由几个碱基隔开。因此转录的RNA片段会形成茎环结构,阻止聚合酶前进。

 

①不依赖ρ因子的终止

不依赖ρ因子的终止子(强终止子)有一富含G:C的二重对称区,其下游有6~8个U;

由这段DNA转录产生的RNA容易形成发夹结构;并在3’端为寡聚U。这两种结构特征决定了转录的终止。

 

 

可能RNA产物形成的所有发夹都会减慢(或暂停)转录。暂停发生的长度各不相同。在典型终止子上暂停持续约60Sec。

聚合酶的暂停为终止发生提供了一个机会。如果暂停位点与终止子不一致,则酶继续进行转录。

 

正确位置(7~9nt)的一段U残基是RNA pol遇到发夹而暂停时从模板解离下来所必需的。

转录产生的RNA-DNA杂交链中的rU:dA碱基配对结构很弱,极易被破坏。当聚合酶暂停时,RNA-DNA杂交链从终止区的弱键rU:dA处解开。

 

通过缺失使U区变短可证明U区段的重要性。这时尽管酶仍在发夹处暂停,但不再终止。

U碱基系列对应DNA富含A:T区域,因此富含A:T区在终止过程中与在起始中同样重要。

 

②依赖ρ因子的终止

ρ依赖型终止作用所需的序列长50~90nt(ρdependent termination, 称为rut位点),位于终止位点上游。它们的共同特征是RNA富含C而少G。ρ依赖型终止子的终止效率随rut区域长度增加而提高。

 

r因子是大肠杆菌的一种基本蛋白,只起终止转录的作用。

 

r因子的活性形式为六聚体(MW 275kD),亚基具有一个RNA结合域和ATP水解域。六聚体具有依赖ATP的解旋酶活性。

 

r因子结合在rut位点,靠水解ATP提供的能量沿RNA的5’→3’方向移动。若聚合酶移动速度因遇到终止子后形成的茎环结构而变慢时,六聚体就可追上而在终止点终止转录。

 

 

依赖ρ的终止子中G:C对含量较少,终止子没有多聚dA序列,转录的RNA在终止子处可形成不稳定发夹结构,引起聚合酶转录暂停。

 

ρ因子的作用机制还不清楚。ρ因子可利用它的解旋酶活性使RNA-DNA解链而释放转录产物,或者通过与聚合酶作用间接引起RNA释放。

无论作用机制如何,终止过程完成后聚合酶、RNA和ρ因子都被释放出来。

 

如果核糖体正在翻译一条RNA,则可阻断ρ因子沿RNA移动,因此,ρ因子接近终止子处RNA聚合酶的能力依赖于翻译过程。

 

抗终止作用

 

5.2.4 RNA转录后加工

原核生物的结构基因是连续编码序列,转录形成的mRNA绝大数不需加工修饰。原核生物没有核膜,转录和翻译是相偶合的,往往转录还未完成已开始翻译。

 

5.2.4.1 原核生物rRNA前体的加工

E. coli的7个编码rRNA的操纵子分散于基因组中,这些操纵子的组成基本相同,均含有16S-23S-5S的三个rRNA分子。每个操纵子都可转录生成一个RNA前体,然后被切割加工为成熟的rRNA分子。

 

原核生物的rRNA和某些tRNA基因组成混合操纵子,它们再形成多顺反子(polycistron)转录物(>5500nts)后通过切割成为rRNA和tRNA前体,进一步加工成熟。

 

16S rRNA后有1~2个tRNA基因,23S和5SrRNA后有0、1或2个tRNA基因。

 

原核生物rRNA转录后加工:

①rRNA在修饰酶催化下进行碱基的甲基化修饰;

②rRNA前体被RNaseⅢ、RNase E、RNase P、RNase F等剪切成一定链长的rRNA分子;

③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基。

 

在16S和23SrRNA间的序列是编码tRNA的序列。

 

16S和23SrRNAs的前体分别称为p16和p23,它们分别比16S和23S略长一些。

P16或p23两端的碱基都有互补区域,它们分别形成巨大顶环的发夹。在RNA酶Ⅲ等一系列酶的作用下,加工成为成熟rRNA。

 

5.2.4.2 tRNA的加工

原核或真核生物中的tRNA基因往往成簇存在。

在E. coli中某些tRNA基因聚集形成操纵子,在基因图15分钟处的操纵子含有7个tRNA基因(Metm-Leu-Gln1-Gln1-Metm-Gln2-Gln2),并由一个启动子转录成一条长的前体RNA链。每个tRNA都是前体RNA的一部分。

E. coli中已找到两个tRNA基因簇,它们除tRNA基因外还含有其他基因。

 

原核生物和真核生物转录生成的tRNA前体无生物活性,经剪切和拼接、碱基修饰、3’-OH连接-CCA结构等加工后才能成熟。

 

①tRNA前体被tRNA剪切酶切成一定大小的tRNA分子。

大肠杆菌RNase P(tRNA 5’成熟酶)可特异剪切tRNA前体的5’端顺序。

RNase D是tRNA 3’端成熟酶,它可将tRNA前体3’端的一段核苷酸序列切除。

 

大肠杆菌RNase P是一种由RNA和蛋白质组成的酶分子。

最近发现RNase P分子中的RNA部分在某些条件下,可以单独地催化tRNA前体的加工成熟,这个发现和四膜虫tRNA能自我拼接被认为是生化领域内最令人鼓舞的发现之一。说明RNA分子确具有酶的催化活性。

 

②成熟tRNA分子中的稀有碱基是通过修饰形成的。

如:嘌呤生成甲基嘌呤;尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶;尿嘧啶核苷转变为假尿嘧啶核苷;腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸等。

 

③3’-末端加上CCA

在核苷酸转移酶作用下,3’-末端除去个别碱基后,换上tRNA分子统一的CCA-OH末端,完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。

 

原核生物中有2种3’-端不同的tRNA前体:Ⅰ型3’-端有CCA序列;Ⅱ型没有CCA,tRNA核苷酸转移酶可将CCA加到3’端。

真核生物中可能所有的tRNA前体都属于Ⅱ型,在成熟时都需要通过酶的作用,在其3’端加上CCA序列。

 

5.2.5 σ因子的替换

σ70可负责正常情况下大多数基因的转录,但环境变化需要不同的σ因子进行应答。

 

例如,温度波动是一种常见的环境压力,许多生物体中会以相似的方式进行应答。温度升高,正在进行的蛋白合成会停止或减少,而一系列热激基因(heat shock genes)开始表达产生新蛋白,保护细胞免受环境损伤,它们也可在其它情况下合成。

 

在E. coli中,转录变化激发了17种热激蛋白质的表达。rpo H基因产物σ32负责开启热激应答反应,引起热激基因转录。

热激应答是通过温度升高时σ32数量增加,温度恢复σ32活性降低来完成诱导。温度增加导致未折叠蛋白质(部分变性蛋白质))在细胞内累积是引起σ32合成的基本信号。σ32不稳定,因此其数量可很快增加或减少。

 

σ32和σ70可竞争地利用核心酶,热激过程中所表达一系列基因依赖于二者之间的平衡。

 

σE可控制另一组热激基因,被胞质周隙或外膜内的未折叠蛋白的积聚所诱导,负责比σ32更剧烈的温度变化时产生应答。

 

σE结合在内膜上的RseA蛋白上,没有转录活性,未折叠蛋白的积累激活了位于胞质周隙的蛋白酶DegS,它切割RseA的C端,切割激活了内膜的YaeL蛋白,YaeL又能切割RseA的N端,使σE被释放。

 

每种σ因子使RNA聚合酶在一系列特定启动子处进行转录起始。不同种类的启动子都有独特的序列元件。每类启动子的序列都保证了其仅被由对应的σ因子指导的RNA聚合酶识别。

 

每种σ因子参与组成的全酶对应的启动子具有相同的大小和位置,并且仅围绕-35和-10区为中心具有保守序列。

 

不同种类启动子的同源序列在-35和-10区位置各不相同。故包含特定σ因子的全酶仅识别自己的一组启动子,因此不同组的转录可分别进行。一个σ因子被另一个替代,就关闭了老的那组基因的转录,而开启新的一组基因转录。

 

σ因子可被组成级联

已知约有10种σ因子用于控制芽孢杆菌(B. subtilis)的转录起始。其中一些存在于生长细胞中,另一些仅存在于特殊环境中,如噬菌体感染,或在生长状态变为芽孢时出现。

在正常生长的枯草芽孢杆菌的RNA pol与E. coli的聚合酶具有相同结构,其σ因子(σ43或σA)识别的启动子与σ70识别的启动子具有相同的共有序列。

 

基因表达的切换是细菌噬菌体感染的共同特征。

例如,噬菌体的发育包含感染循环中转录模式的很多转换,这些转换或是通过由合成噬菌体编码的RNA pol来完成、或是由噬菌体编码的辅助因子控制细菌RNA pol来完成。通过产生新的σ因子实现转录控制的一个典型例子发生于噬菌体SPO1感染芽孢杆菌的过程中。

 

SPO1的感染循环经历基因表达的3个阶段。感染后,噬菌体的早期基因立即被转录。4~5min后,早期基因停止转录,中期基因转录开始。8~12min,中期基因转录被晚期基因转录取代。早期基因转录由宿主的全酶α2ββ’σ43负责。宿主聚合酶不能分辨自身的基因和外来基因。

 

从早期、中期到晚期基因转录的转变需要噬菌体基因的表达。3种调控基因28、33和34能控制转录过程。

调控模式产生一个级联反应:宿主酶转录的一个早期基因产物是中期基因转录必需的,而两个中期基因产物又是晚期基因转录所必需的。

 

基因28的产物(gp28)取代核心酶上的宿主σ因子。这种替代是从早期向中期表达换变所必需的唯一事件。产生的全酶特异地转录中期基因而不再转录宿主基因。

两个中期基因参与了下一步转变:基因33或34的产物形成二聚体置换核心酶上的gp28,一旦它们与核心酶结合就能够在晚期基因的启动子上起始转录。

 

σ因子的连续置换有双重结果。每当亚基改变,RNA pol就能识别一组新基因,而不再识别以前的基因。这种转换造成了RNA聚合活性的整体变化。可能所有核心酶都会与σ因子结合,并且这种变化不可逆。

 

某些细菌芽孢形成涉及广泛的σ因子转换。

在营养生长期末,由于培养基中的营养枯竭,对数生长停止,触发芽孢的形成。DNA复制,基因组聚集于一端,最终被芽孢坚硬的被膜所包围。

 

隔膜(Septum)形成产了生两个独立的区域化部位:母细胞和前芽孢。此过程开始时,一条染色体附着在细胞的一极。正在生长的隔膜将染色体的一部带入前芽孢中,然后,易位酶(Translocase,SpoIILE)将染色体的其余部分泵入前芽孢中。

 

芽孢(spore)形成约需8h,这可当成一种原始类型的分化,一个母细胞(生长的细菌体)产生两个不同命运的子细胞。母细胞最终被裂解,被释放芽胞的结构与细菌完全不同。

 

芽孢形成使细菌的生物合成活性发生剧烈变化,这中间涉及到许多基因。而基本的调控则发生在转录水平,一些在生长期行使功能的基因被关闭,但多数仍继续表达。另外,芽孢特异性基因仅在此时期表达,在芽孢形成末期,约40%的细菌mRNA为芽孢特异性的。

 

成芽细胞中新RNA pol被激活。RNA pol含有与生长周期相同的核心酶,但不同的σ因子取代了生长期细胞的σ43。转录特异性变化的原则是每个区域化部位中的σ不断被取代,导致不同基因的转录,而区域化部位间的物质和信息交流协调着前芽孢和母细的时相性。

 

芽胞级联反应起始于环境中触发的“磷酸化接力级联过程”。磷酸基团经过一系列蛋白传递最终到达SpoOA。SpoOA是一个活性受磷酸化影响的转录调控因子。它在磷酸化形式下能激活两个操纵子。

 

磷酸化的SpoOA指引宿主酶利用σ43转录编码σF因子的基因;利用σH转录编码前体σE的基因。新的σ因子在隔膜形成前产生,以后被激活。

 

σF是前芽孢区域化部位中第一个被激活的因子。σF被抗σ因子抑制,在前芽孢中抗-抗σ因子可去除抑制物。

 

σF的激活由一系列磷酸化/去磷酸化控制。起始决定物为一种跨膜的磷酸酶(SpoⅡE),它聚集在一极使其磷酸酶结构域在前芽孢中聚集。SpoⅡE的去磷酸化激活SpoⅡAA。SpoⅡAA反过来又置换SpoⅡAB-σF复合物中的抗σ因子SpoⅡAB,σF的释放能将自己激活。

 

σF的激活是芽孢形成的开始。在σF的指引下,RNA pol停止转录生长期基因,而转录第一套芽孢基因。由于σF数量少,所以置换反应可能只发生在一部分RNA pol。某些生长期的酶在芽孢期仍然存在。被置换下来的σ43没被破坏,可以从芽孢细胞提取物中获得它。

 

σF的激活后发生两个调控事件。在前芽孢内σG因子是早期基因的产物,σG可使聚合酶转录前芽孢中的晚期芽孢基因。另一个早期芽孢基因产物负责与母细胞区域化部位的信息交流。σF可激活来自前芽孢的SpoIIR。SpoIIR可激活膜结合蛋白质SpoIIGA,使母细胞中σE的前体活化。

 

当σE依次被σK替换级联反应继续进行。

σE转录出σK的前体可被蛋白酶活化。一旦σK被激活就置换σE,从而引起母细胞内晚期基因转录。

 

两个区域化部位一系列事件发生的时相通过其它信号通路来协调。母细胞中σE的激活是前芽孢中σG激活所必需的;而σG的激活产生信号穿过隔膜激活σK。

 

因此,芽孢形成通过两个级联反应控制。每个区域化部位中的σ因子被成功激活,分别指导一套特定基因转录。

 

当新σ因子被激活时,旧σ被置换,因此σ的转换控制了基因的开启或关闭。每个σ与聚合酶的结合都使相应的一套靶基因表达;因子数量可影响基因表达水平。在任一时刻,可能不止一个因子被激活,并且某些σ的专一性可相互重叠。

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