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5.3 真核生物RNA的合成与加工
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:11346    更新时间:2011/4/15
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5.3.1 真核RNA pol

在真核生物中已发现了RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ、线粒体RNA pol和叶绿体RNA pol等,它们专一性地转录不同的基因。

 

线粒体和叶绿体的RNA pol类似于细菌的RNA pol。

参与叶绿体基因转录作用的RNA聚合酶至少可分为两种不同的活性类型,一种是由叶绿体基因编码的可溶性RNA聚合酶。另一种是由核基因组编码的叶绿体RNA聚合酶,主要转录rRNA基因。它是同叶绿体DNA紧密结合形成的复合物,称为转录活跃的染色体。

 

鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶特异抑制剂,3种真核RNA pol对鹅膏蕈碱的敏感性不同。

 

 

 

真核生物的RNA聚合酶

 

RNA聚合酶Ⅰ位于核仁中,负责转录编码rRNA的基因(细胞内绝大部分RNA是rRNA)。

RNA聚合酶Ⅱ位于核质中,负责核内不匀一RNA的合成,而hnRNA是mRNA的前体。

 

RNA聚合酶Ⅲ负责合成tRNA和许多小的核内RNAs。

原核生物靠RNA聚合酶就可完成从起始、延长、终止的转录全过程,真核生物转录除RNA聚合酶外还需另一些叫做转录因子的蛋白质分子参与转录的全过程。

 

酵母的RNA聚合酶有12个亚基,晶体结构已定位了聚合酶Ⅱ的10个亚基,催化亚基位于两个大亚基间的缝中,当DNA进入聚合酶时下游的钳子(jaws)结构可夹住DNA链。

 

酵母的聚合酶与细菌聚合酶有相似的结构。

 

在酶的活性中心还有Mg2+。

 

由于蛋白分子的空间阻隔,DNA在活性位点的入口处改向。

 

转录泡处有9bpd的DNA-RNA杂交链

 

5.3.2 真核启动子

真核生物有三种RNA聚合酶,分别都有自己的启动子。

RNA聚合酶Ⅱ启动子核苷酸序列的共同特点:

①在-25区有TATA框,又称为Hogness box或Goldberg-Hogness box。保守序列为T28A97A93A85A63T37A83A50T37,富含A、T,TATA框决定了转录起点的选择。

 

②在-75区有CAAT框,保守序列为GGTCAATCT。CAAT框与转录起始频率有关。

真核转录起始点附近有增强子,它能增强启动子的活性,可存在于启动子上游或下游。

 

5.3.3 真核RNA合成起始和延伸

真核生物转录起始十分复杂,需要多种蛋白因子的协助,细胞中有一类转录因子可与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物,共同参与转录起始过程。

 

RNA聚合酶II及转录因子是在启动子上的装配

真核生物的RNA聚合酶借助于转录因子来辨认启动子及解开双螺旋。

与RNA PolⅡ联合的转录因子有TFⅡA、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF和TFⅡH等6种。

TF:Transcription Factor;

Ⅱ:RNA PolⅡ。

 

TBP的核心区域与TATA box的复合体结构。

 

TFⅡD能与启动子结合,并吸引其它转录因子以及聚合酶进到转录启动区。

转录因子与RNA polⅡ共同组成转录起始复合物,转录才能在正确的位置上开始。

 

TFⅡH利用ATP的能量解开双螺旋。DNA熔链的位置约从转录起点上游10bp开始,RNA PolⅡ根据模板链的碱基顺序将NTP聚合成RNA。

在RNA延伸的阶段,除了TFⅡF仍与聚合酶结合外,其余的转录因子都离开RNA PolⅡ。

 

RNA PolⅡ最大的亚基C端的一段肽链称为CTD(carboxyl-terminal domain)。含有很多个脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸。启动转录时CTD需处在未磷酸化状态。启动后CTD需被磷酸化才能延伸RNA。

 

真核基因转录起始是基因表达调控的关键,多种蛋白因子间相互作用,以及这些蛋白因子与DNA元件相结合,构成控制基因转录开始的复杂体系。

 

真核生物转录的延伸阶段与原核生物相似。合成速度30~50nt/S,但速度不定,遇到G/C后,时间延迟。

 

5.3.4 真核RNA合成的终止

对真核生物转录的终止和机制了解很少。由于RNA转录后很快就进行加工,很难确定原初转录物的3’-末端。

病毒SV40的终止位点经过研究发现,很像大肠杆菌的不依赖ρ因子的终止子,转录后的RNA可形成一个发夹结构,3’-末端带有polyU。

 

爪蟾5s rRNA的3’-末端有4个U,其前后为富含G、C的序列,这是所有真核生物RNA polⅢ转录的终止信号。这种序列特征高度保守,从酵母到人都很相似。

RNA polⅠ转录rRNA的基因,它的终止反应涉及一个辅助因子对由18个碱基构成的终止子的识别。

 

RNA PolⅡ所转录的基因在最后一个外显子下游都具有一个加Poly-A的信号AATAAA序列,而RNA PolⅡ一般在该位点下游停止转录。

 

其实,加尾开始后RNA链被切断,转录由于加工酶从聚合酶CTD尾巴的转移而使聚合速度降低,但仍然合成出第二个RNA分子,可能由于第二个RNA缺乏帽子结构,被聚合酶识别为不正确的转录物导致转录终止。

 

5.3.5 RNA转录后的加工与修饰

真核细胞所有RNA都是以复杂的初级转录物形式被合成的。似乎RNA的加工成熟对调节mRNA、rRNA和tRNA从胞核到胞浆转运起关键作用。

 

转运

 

5.3.5.1 mRNA的加工修饰

真核生物转录和翻译在时间和空间上是分开的,刚转录出来的mRNA分子是复杂的前体,且大小很不一致,即核内不均一RNA (heterogeneous nuclear, hnRNA)。

 

RNA pol的CTD在延伸过程中被磷酸化,可募集5’加帽酶、剪接机器的组分以及多聚腺苷酸化所需要的酶。其实在RNA被合成达到20~40nt时就开始进入加工阶段。

 

hnRNA与蛋白质结合成核糖核蛋白颗粒(hnRNP)。

 

hnRNA分子经裂解和拼接,只有少部分序列转变为成熟的mRNA,其余在加工过程中被降解。

 

hnRNA半寿期一般为几min~1hr,比细胞质中的mRNA更不稳定,细胞质mRNA的半寿期为1~10hr,神经细胞mRNA的半寿期最长可达数年。

真核生物转录生成的mRNA为单顺反子。

 

mRNA的加工修饰包括:5’端形成帽子结构、3’端加polyA、剪接除去内含子和甲基化。

 

①5’-端加帽

成熟的真核生物mRNA的5’-端有m7GPPPN结构,称为甲基鸟苷帽子。

它是在RNA三磷酸酶,mRNA鸟苷酰转移酶,mRNA(鸟嘌呤-7)甲基转移酶和mRNA(核苷-2’)甲基转移酶催化形成的。

 

不同的甲基化可形成3种帽子类型:0、1和2。

鸟苷以5’-5’三磷酸键与RNA的5’-端相连。当G第7位C被甲基化形成m7GPPPN时,此结构称为“帽子0”。存在于单细胞生物。

 

如果RNA的第1位核苷酸的2’-O位也甲基化,形成m7GPPPNm,称为“帽子1”,普遍存在;

如果RNA的第1、2位核苷酸的2’-O位均甲基化(2位必需是A),成为m7G-PPPNmNm,称为“帽子2”,此结构发生很少。

真核生物帽子结构的复杂程度与生物进化程度关系密切。

 

5’帽子的功能

mRNA 5’-端帽子结构是翻译起始所必要的,为核糖体识别mRNA提供了信号,并协助核糖体与mRNA结合使翻译从AUG开始。

帽子结构可增加mRNA的稳定性,保护mRNA免遭5’→3’核酸外切酶的攻击。

 

②在3’-端加尾巴

大多数真核mRNA在3’-端都有约150~200nt的Poly(A)尾巴。Poly(A)尾是转录后在核内加上的。

 

根据Poly(A)尾巴的特点可从众多的RNA中分离mRNA。

 

真核基因的3’端有AATAA、YGTGTGYY(Y为嘧啶)序列,作为mRNA 3’-端加polyA尾的信号。

 

hnRNA链被RNaseⅢ在加尾巴信号下游11~30nt处切断磷酸二酯键,polyA聚合酶催化在3’-OH上逐一引入100~250个A。

 

 

Poly(A)尾巴的功能

防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解,起缓冲作用。

可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关。但是相当数量的没有polyA尾巴的mRNA如组蛋白mRNA,也能通过核膜进入细胞质。

 

Poly(A)尾巴可能对真核mRNA的翻译效率具有某种作用,使mRNA较容易被核糖体辨认。

3’-脱氧腺苷(冬虫夏草素)是多聚腺苷酸化的特异抑制剂,但它不抑制hnRNA的转录,它的存在可阻止细胞中出现新的mRNA,表明多聚腺苷酸化对mRNA的成熟是必要的。

 

③mRNA甲基化

真核mRNA往往有甲基化位点,主要是在N6-甲基腺嘌呤(m6A)。这种甲基化修饰对翻译没有必要,可能在mRNA前体加工中起识别作用。

 

④mRNA前体(hnRNA)的拼接

真核生物的结构基因中具有可表达活性的外显子,也含有无表达活性的内含子(断裂基因)。

 

内含子的数量与所在基因的大小有关。许多基因中的内含子参与基因表达调控。外显子一般大小为100~200pb,内含子>1kb。

 

在转录时,外显子及内含子均转录到hnRNA中。核中hnRNA在核酸内切酶作用下剪切掉内含子,然后在连接酶作用下,将外显子各部分连接起来,而变为成熟的mRNA。

 

 

mRNA前体剪接位点是由内含子末端的序列规定的。

通过对100多种真核细胞基因的分析,发现所有内含子都是以GU开始,以AG告终的保守序列(称GT-AG规律,此规律不适合于线粒体和叶绿体的内含子,也不适合于tRNA和某些rRNA的结构基因)。同时内含子还有一个重要的内部位点——分支点。

 

转录物中内含子和外显子交界处的碱基序列

 

RNA的剪接过程中内含子的切除可能有一定的顺序。

通过RNA blotting可以证明。卵粘蛋白的hnRNA先切除5和/或6,然后切除4和7,最后切内含子3。

 

原则上5’剪接点可与任一3’剪接点发生剪接,但实际上剪接只发生在同一个内含子的5’和3’剪接点间,其机制尚不明。

 

mRNA前体的内含子末端的序列剪接位点突变引起剪切错误。剪切位点突变导致地中海贫血症(thalassemia),地中海贫血症起因于血红蛋白合成缺陷。此类贫血症中有一类是异常剪接引起。

β-珠蛋白的第一内含子发生突变,突变位点发生在正常3’剪接位点上游20nt处。

 

正常人是G,病人是A,即G→A。导致产生了一个新的3′剪接位点(原位点上游),新剪切位点剪切,使mRNA中密码子变化。在新剪切点后提前出现蛋白质合成的终止密码子。结果合成了异常的血红蛋白β-亚基,导致贫血症。

 

mRNA前体拼机制

真核细胞内存在许多种大小在100~300nt的小分子RNA,由聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录。它们与蛋白质形成复合物参与RNA的拼接反应。

如核内小RNA(snRNA)主要存在于核内,细胞质小RNA(scRNA)主要存在于细胞质。

 

重要的snRNA有U系列(尿嘧啶含量高而得名)snRNA,U系列snRNA与蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒(RNP)。U-snRNA参与hnRNA的拼接过程。U3-snRNA与rRNA前体的加工有关,U1、U2、U4、U5、U6可能都与hnRNA的加工有关。

 

snRNP和其他辅助蛋白共同组成一个剪接体,它能对内含子3’和5’剪接位点和分支点进行识别,进行剪接作用。

 

 

 

剪接体组成

 

mRNA前体在SnRNP等的参与下,内含子中分支点部位的腺苷酸(A)残基的2’-OH自动攻击内含子5’端与外显子1连接的磷酸二酯键,切下外显子1。

 

腺苷酸原来已有3’,5’-磷酸二酯键依然存在,加上此2’,5’-磷酸二酯键连接后,在腺苷酸处出现了一个套索。

 

已被切下的外显子1的3’-OH攻击内含子3’-端与外显子2间的3’,5’-磷酸二酯键使其断裂,内含子以套索的形式被切下。外显子1和2相互连接。

 

剪接机制可能与核酶作用相似。

 

编码蛋白质的基因中内含子一般可分为三类。核内pre-mRNA在5’、3’端有一保守的GT…AG双核苷酸和分支点,它们在二级结构方面没有其他共同特征。在细胞器和细菌中存在Ⅰ类和Ⅱ类内含子(低等真核生物的细胞核中也含有Ⅰ类内含子)。Ⅰ类和Ⅱ类内含子是根据它们的内部组成分类的。每种内含子都可以折叠成典型的二级结构。

 

Ⅰ类和Ⅱ类内含子具有RNA自我切割的能力,称为自我剪接(详见核酶)。

 

5.3.5.2 rRNA转录后加工

真核生物rRNA基因有几十至几千个拷贝数,这些拷贝串联重复。其中18S rRNA、28S rRNA和5.8S rRNA基因成簇排列组成一个转录单位,彼此被间隔区分开,由RNA polⅠ转录成一个rRNA前体。

 

哺乳动物的初级转录产物为45S,低等真核生物的rRNA前体为38S(果蝇38S rRNA前体、酵母35S rRNA前体)。

 

5S rRNA基因也成簇排列,存在于另一个转录单位,间隔区不被转录,由RNA polⅢ转录(为内部启动子)。

 

真核生物rRNA的加工类似于原核细胞。

 

真核生物rRNA前体必需经过切割和修整反应才能形成成熟的rRNA。其加工过程比较缓慢,其中间产物可分离出来,因此,真核生物rRNA的加工过程比较清楚。

哺乳动物的初级转录物是一条45SRNA,含18S、5.8S和28S rRNAs。

 

在转录过程中或刚转录完成时,rRNA中约有1~2%的核糖单位的2’-OH被S-腺苷甲硫氨酸经酶促而甲基化。在被加工成熟的rRNAs中,这些甲基全部被保存。

在成熟的18S rRNA上有约39个原来的甲基,只有4个是在细胞浆中加上的。

在28SrRNA中有约74个甲基,全部是原来的。甲基的存在是初级转录物转变成熟的rRNA的标志。

 

rRNA加工和修饰需要一组核仁小RNA(small nucleolar RNAs,snoRNAs)的参与。snoRNAs与rRNA靶序列配对,产生修饰酶作用的靶位点。

至于剪接反应,可能还要涉及snRNA等的作用。

 

成熟的途径可能不止一条,而最终产物都是一样的。

人类45S RNA与小鼠的45S RNA加工方式不同。

 

酵母rRNA加工途径

 

哺乳动物的原始转录物可能不是45S而是47S。由于3’和5’端部分很快进行转录处理除掉一小部分变为45S。

 

5S rRNA和tRNA都是由RNA polⅢ转录的。

真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所,大、小亚基分别组装后,通过核孔转移到胞质中参与核糖体循环。

 

 

5.3.5.3 tRNA转录后的加工修饰

真核tRNA基因数目比原核的要多。E.coli有60多个tRNA基因,果蝇850个,爪蟾1150个,人1300个。

真核tRNA基因也成簇排列,被间隔区分开,tRNA基因由RNA polⅢ转录。

真核生物转录生成的tRNA前体需进行加工修饰才有生物活性。

 

酵母约有272个tRNA基因,有59条为断裂基因,每条含有1个内含子,内含子长度14~60bp,无保守性。

酵母tRNA的剪切和连接是两个独立的反应。切除内含子的酶是识别tRNA的二级结构,而不是保守序列。

 

酵母tRNA的内含子中都含有一段与反密码子环互补的序列,结果使反密码子环构象改变,而其它部分结构正常。

 

tRNA的剪接需要独立的核酸酶和连接酶活性。由内切酶保证内含子识别的专一性,在内含子两个末端进行tRNA的剪接。酵母的内切酶为多亚基蛋白质,其中一个亚基通过“测量”与tRNA的某一点距离来确定切割位点。

 

首先核酸内切酶将内含子-外显子边界切断,产生2’-3’-环形磷酸和5’-OH末端(这不同于其他的RNA剪接酶),接着环形磷酸被打开产生3’-OH和2’-磷酸,5’-OH末端被磷酸化。内含子释放出来后,剩下的tRNA半分子折叠成一个含5’磷酸及一个3’-OH裂口的类tRNA结构,最后裂口被连接酶缝合,2’-磷酸被磷酸酶除去。

 

tRNA经过剪切、拼接、碱基修饰以及3’-OH端连接-CCA结构成为成熟的tRNA。

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