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5.4 RNA的自我剪切与催化
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:4868    更新时间:2011/4/15
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5.4.1 ribozyme的发现

以前一直认为只有蛋白质有酶活性。近年发现一些RNA分子具有高度专一的催化活性,在无蛋白质情况下能进行剪切反应,称为ribozyme。

美国的Thomas Cech等以一种含巨大细胞核、带鞭毛的单细胞原生动物四膜虫为材料,研究其26S rRNA前体成熟过程时,发现rRNA前体的剪接作用可在大核的提取液中进行。

 

Cech等只想纯化催化rRNA前体剪接的酶系,但实验中却发现:只含rRNA前体和鸟苷酸而未加入大核提取液,即不含蛋白质的对照也能进行rRNA的剪接反应。且剪接活性随着rRNA前体纯度的增加而升高,并且具有抗蛋白酶的性质,在SDS去污剂存在下还有较强的耐热性。

 

用酚法提取和纯化时,剪接活性随纯化度而增加,排除了四膜虫大核中蛋白质与rRNA前体紧密结合难分开的可能性,表明四膜虫26S rRNA前体存在自我剪接的催化活性。

 

以重组四膜虫rDNA的一个大片段(含Intron)为模板,用大肠杆菌RNA pol在试管中转录的rRNA前体,也能发生自我剪接。进一步排除了有任何蛋白质(酶)参与此催化反应的可能性,也证实了四膜虫rRNA前体的自我剪接作用的特性。

Cech和Altman获1989年Nobel化学奖。

 

5.4.2 ribozyme的特点和作用方式

ribozyme首先在细胞核中发现,主要存在于核中,但在胞质以及病毒和类病毒中也有发现。至今已发现数十种不同的ribozyme,化学本质都是RNA。

 

ribozyme的大小从十几个nt到数百个nt;底物多为RNA(也有DNA、糖类、氨基酸酯等),ribozyme的催化效率较酶(蛋白质)低得多;必需有Mg2+存在时才能进行催化;它也具有催化作用的专一性。

Ribozyme的作用方式有剪切型和剪接型两大类型。

 

剪切型的作用相当于内切核酸酶的作用,可催化RNA分子切除一段核苷酸序列。

剪接型的作用相当于内切酶和连接酶两种酶的联合作用,催化自身RNA进行剪切和连接。

ribozyme的剪切作用和剪接作用都不需要其它酶(蛋白质)参与,称为自我剪接(Self-Splicing)和自我剪切(self-cleavage)作用。

 

5.4.3 剪接型ribozyme的作用机制

一些低等真核生物细胞核rRNA前体及线粒体中的某些mRNA前体和rRNA前体的自我成熟过程都是自我催化进行的,因此它们都是自我剪接型的ribozyme。

 

根据剪接型ribozyme的结构持征及剪接机制,剪接型ribozyme可分为两类。

第一类的催化反应需Mg2+和鸟苷或5’鸟苷酸参与,鸟苷必须有游离的3’-OH,剪下来的内含子生成环状中间产物。

这类剪接ribozyme主要有四膜虫大核26s rRNA的前体、酵母线粒体中核糖体大亚基的rRNA前体、酵母线粒体中Cytb的mRNA前体、T4噬菌体胸苷酸合成酶的mRNA前体等。

 

第二类的催化反应只需Mg2+,不需要鸟苷或5’鸟苷酸,剪下的Intron生成一个套索(lariut)形式的中间产物。

属于这类剪接型ribozyme的有酵母线粒体Cyt氧化酶的mRNA前体、酵母线粒体Cytc的mRNA前体、酵母线粒体脱辅基Cytb的mRNA前体、酵母线粒体中核糖体大亚基的rRNA前体等。

 

①第一类剪接型核酶催化的自我剪接机制

四膜虫的rRNA基因被转录成一个35S的初级转录物(约6400nt)。

如将35S前体RNA在体外温育,它能自动切除26S rRNA序列中的413nt的内含子,然后加工生成5.8S、17S、26S rRNA。

 

鸟苷的3’-OH攻击内含子的5’剪接点,并与Intron的5’-端磷酸基形成共价键连接,同时5’外显子脱落下来,但3’外显子此时仍与Intron相连。

 

5’-端外显子的3’-OH进攻内含子的3’剪接点并使413nt的内含子脱落,同时5’外显子与3’外显子连接成成熟rRNA。

在这两步反应中仅涉及转磷酸酯作用,并未改变磷酸二酯键的数目。

 

内含子3’-端鸟苷酸的3’-OH进攻内含子5’端附近的磷酸二酯键,使内含子从5’-端失去包括开始反应中加入的G在内的15nt,自身形成399nt的环状中间产物。

 

399nt的环状中间产物开环后,5’-端又失去4nt片段,又环化形成395nt的小环状分子,再经开环最后得到共失去19nt的线状内含子,称为L19RNA。

 

②第二类剪接型核酶催化的自我剪接机制

酵母线粒体某些mRNA或rRNA前体中的内含子中一个腺苷酸上的2’-OH,进攻内含子的5’剪接点并生成2’,5’-磷酸二酯键,形成一个与3’外显子尚未脱离的“套索”式中间产物,同时5’外显子被剪下。

 

脱落的5’外显子中的3’-OH攻击内含子的3’端剪接点,剪下的3’外显子并与5’外显子连接成成熟的mRNA或rRNA,内含子则以套索形式被剪切下来而被核酸酶降解。

 

这类自我剪接的反应机制与高等真核生物细胞核mRNA前体的剪接作用很相似。但区别在于高等真核细胞核mRNA前体需要多种snRNP参与生成剪接体,进行非自我性的剪接。

 

5.4.4 剪切型核酶及其作用机制

剪切型ribozyme是将自身RNA或异体RNA切除一段特异的核苷酸序列。它只剪不接。

加拿大的Sidney Altman发现大肠杆菌的RNase P是特异水解各种tRNA前体5’-端前导序列核苷酸片段的酶。

 

纯化的RNase P是由蛋白质和M1RNA两部分组成,其中蛋白质的分子量为20kD,Ml RNA由377nt组成。这两个组分单独存在时均无催化活性,但如分别加入高浓度的Mg2+时,单独的Ml RNA即可催化tRNA前体5’-端的成熟,而单独的蛋白质部分则无催化活性。如在有Mg2+存在的Ml RNA中再加入此蛋白质,则催化活性增加。

 

因此,MlRNA是一种剪切型ribozyme,而Mg2+和蛋白质部分仅是使RNA维持催化活性所需特异构型或构象的辅助因素而已。

 

RNase P中的M1RNA分子中有一个活性核心。用核酸酶处理MlRNA以除去其3’-端的122nt,结果发现活性只是有所下降;若除去其5’端的70nt序列则活性完全丧失。表明保持MlRNA的5’-端序列是维持其催化活性所需构型必不可少的。

 

大肠杆菌、枯草杆菌和鼠沙门氏杆菌等不同原核细胞来源的RNase P中ribozyme的一级结构虽然有所不同,但它们可与RNase P的蛋白质组分进行交叉重组,而得到都表现催化活性的杂合RNase P,表明这些不同来源的ribozyme具有相似的三维结构。

 

Cech等发现四膜虫大核rRNA前体经自我剪接后切下的内含子,再经过两次环化和开环作用而切除19个核苷酸后生成的L19RNA具有磷酸二酯酶、酸性磷酸酶、磷酸转移酶、核苷酸转移酶和RNA限制性内切酶等五种水解酶活性,不过它们的底物都是RNA。

因此Ll9 RNA既有RNA水解酶(RNase)的作用,又有RNA聚合酶(po1ymerase)的作用。

 

含395nt的L19RNA(ribozyme)的三维结构尚不清楚,但根据其一级结构特点,Cech认为C5能与L19RNA分子个的特定部位结合,提出了理论推断以解释其水解酶和RNA pol的双重催化的机制。

 

底物C5中的C与L19RNA中富含G序列互补配对,L19RNA的3’-G的3’-OH攻击C5的第4与第5个胞苷酸二酯键,生成5’…-GpC中间物和C4。生成的新磷酸二酯键很不稳定,极易水解放出5’-pC,L19RNA则恢复原状。这是L19RNA的水解(RNase)作用。

 

与水解反应交替进行的是L19RNA的5’…GpC中间产物可与另一个C5结合,复合物中第5个胞苷酸3’-OH攻击该中间产物5’…GpC中G、C间的磷酸二酯键,其中的pC与底物C5形成1分子C6,同时L19RNA恢复原状。这是L19RNA的RNA pol作用。

 

Symons提出“锤头”状结构模型解释剪切型RNA的作用机制。实验证明无论是ribozyme本身或ribozyme与底物RNA间,若具备锤头状结构和特定的13nt保守序列,剪切会在锤头结构的GUN序列的3’-端自动发生。N是除G的任意碱基,N的2’-OH是剪切所必需的。

 

Symons等制备了一种含324nt的紫花苜蓿短暂条纹病毒的拟病毒RNA正链中的55nt,证实了由它形成的锤头状二级结构能进行自我剪切反应。

锤头结构由催化部分(ribozyme, R)和底物部分(substrate, S)组成。

 

人工合成的13聚核糖核苷酸是目前已知最小的ribozyme。

若将13聚核糖核苷酸换成13聚脱氧核糖核苷酸则无活性,表明锤头结构中ribozyme分子中核糖重要性。

 

Ribozyme的发现对于了解生命进化过程有重要意义。很可能在原始生命中,RNA所催化的断裂连接反应是最早出现的催化过程。

人们试图设计和生产酶分子,但因蛋白质分子结构上的复杂性,尚无成功的例子。

随着ribozyme的发现,人工酶的设计又产生了新的希望。根据锤头结构的自我剪切模型和理论,澳大利亚科学家设计的几个ribozyme都具备内切酶的活性,且切割位点有高度特异性。

 

核酶的活性呈现出典型的酶特性。由于其作用位点高度特异,可以用来切割特定的基因转录产物(RNA)。将这种切割作用称抗基因活性。因为切割的结果破坏了RNA,即抑制了基因表达。

核酶可用于抑制细胞内肿瘤基因、遗传缺陷基因以及病毒基因等不良基因的表达,为基因治疗提供一种可行的途径和美好的前景。

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