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6.2 体外翻译系统
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:1867    更新时间:2011/4/15
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在生物体内,蛋白质合成过程中需要200多种生物大分子参加,包括核糖体、mRNA、tRNA及多种蛋白质因子。

蛋白质体外合成实验

用活跃进行蛋白质合成的大肠杆菌制备细胞提取液,并用放射性同位素标记(3H、14C、35S)的氨基酸以研究氨基酸掺入到蛋白质中的情况。

 

低温破碎迅速生长的大肠杆菌细胞,离心收集细胞液,加入DNase破坏DNA;在含有核糖体、mRNA、tRNA及酶的细胞液中加入ATP,GTP和放射性氨基酸,于37℃保温不同时间;沉淀蛋白质,从沉淀的放射活性测出氨基酸掺入蛋白质的量。

由于在提取液中存在RNase使mRNA分解,合成一般只进行几min便逐渐减慢以至停止。

 

如果加入新的mRNA于已停止合成蛋白质的提取液,又可重新开始合成。这证明无细胞体系也可以进行蛋白质的合成。同时,蛋白质合成需要mRNA作为模板。而且用已停止合成蛋白质的提取液,加入不同的mRNA,都可进行蛋白质的合成。

 

1962年,用E. coil提取液进行体外合成实验,加入细菌病毒f2的RNA,合成了与天然f2蛋白完全相同的蛋白质。证明在体外条件下可准确地按mRNA的遗传信息合成相应的蛋白质。

现在已用无细胞系统合成多种病毒和细菌蛋白以及哺乳动物蛋白(如血红蛋白、轻链和重链免疫球蛋白、肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白等),证明高等生物蛋白也能在体外合成。

 

无细胞翻译体系自身的mRNA可被自解,在加入外源mRNA(人工合成模板)则可利用无细胞翻译体系的蛋白质合成组分,研究mRNA的编码情况。

用于蛋白质的生物合成研究的体外翻译系统主要有:细菌(大肠杆菌)无细胞系统、动物无肝细胞系统、网织红细胞裂解系统和麦胚系统等。只要加入外源mRNA模板,则可进行体外翻译。

 

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