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6.3 遗传密码的破译
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:2889    更新时间:2011/4/15
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基因密码的破译是多位科学家从五十年代开始,先后经过了数学推理和一系列实验研究,于1966年才解决了这个问题。

 

6.3.1 遗传密码的推测阶段

1954年物理学家George Gamov提出遗传密码的问题,并根据DNA中有4种核苷酸和蛋白质中有20种氨基酸的对应关系,推理认为3个核苷酸为一个氨基酸编码,可编64种氨基酸(43=64)是最理想的。因为在有四种核苷酸条件下,64是能满足于20种氨基酸编码的最小数。

 

6.3.2 三联密码的验证

破译遗传密码最简单的方法应是将DNA顺序或mRNA顺序和多肽相比较。1961年,Brenner和Crick用T4噬菌体实验证明加入或减少1或2个核苷酸可导致形成不正常的蛋白质,但加入或减少3个核苷酸则生成的蛋白质常具有完全的活性。因此认为遗传密码是由3个核苷酸组成的,这被以后的实验证明。

 

6.3.3 细胞系统的建立

1960年,虽然已经清楚RNA参与蛋白质合成的轮廓,但由于只有测定肽链氨基酸顺序的方法(1954年Sanger用纸层析分析了胰岛素的结构,耗时10年),而缺乏测定核苷酸顺序的成熟方法。因此很难知道一个基因的核苷酸顺序和对应多肽的氨基酸顺序的关系,而无法破泽遗传密码。

 

利用体外翻译系统和人工合成的已知碱基顺序的mRNA进行体外蛋白质合成,观察氨基酸掺入情况便可以了解编码各种不同氨基酸的密码子。

在1955年Grunberg等从细菌中分离出多核苷酸磷酸化酶(polynucleotide phosphorylase),催化RNA分解。

RNA+Pi→核糖核苷-Pi-Pi

 

在核苷二磷酸开始浓度很高时,多核苷酸磷酸化酶可催化核苷酸间形成3’,5’磷酸二酯键,生成RNA分子。

5’…APAPAOH+PPA→…APAPAPAOH+Pi

用多核苷酸磷酸化酶合成RNA并不需要模板DNA或RNA;人工合成产物的碱基成分完全随加入反应混合物中的不同核糖核苷二磷酸的比例而异。

 

当只加入腺苷二磷酸时,生成的RNA只含腺苷酸,称为多腺苷酸或多聚A。同样也可合成poly U、poly C、poly G。

加入2个或多个不同的核苷二磷酸,则生成混合共聚物,如poly AU、poly AC、poly CU、poly AG等。这些混合共聚物的碱基顺序近似于随机排列,而且决定于反应物的相对浓度。例如,用A:U=2:1混合物,则生成的多AU的碱基顺序可能为UAAUAUAAAUAAUAAAAUAUU…

 

1961年,Nirenberg和Mathaei合成了polyU作为模板,加入体外无细胞翻译系统中。将翻译产物分析后,发现合成的肽链中的氨基酸残基全部是Phe。确认了第一个Phe的密码子(UUU)。以polyA和polyC为模板,证明了分别可指导合成poly Lys和poly Pro,确定了AAA是Lys的密码子,CCC是pro的密码子。

 

但类似的实验不能证明GGG是何种氨基酸的密码子,因为polyG产生牢固的氢键结合,形成三股螺旋,而不与核糖体结合。

另外,含两种以上的碱基的密码子。如多聚AC分子可以含有8种不同的密码子:CCC,CCA,CAC,ACC,CAA,ACA,AAC,AAA。除已知CCC和AAA分别编码脯氨酸和赖氦酸外,其它密码子则无法破泽。

 

6.3.4 特定共聚核苷酸

1963年,Speyer等用2个碱基的共聚物(mixed copolymers)破译密码的方法。

以A和C原料合成polyAC。polyAC含有8种不同的密码子:CCC、CCA、CAA、AAA、AAC、ACC、ACA和CAC。实验中AC共聚物作模板翻译出的肽链由6种氨基酸组成,即Asn、Gln、His、Thr、Pro和Lys,其中Pro和Lys的密码子已证明是CCC和AAA。

 

这些氨基酸的掺入比例随A/C比率而异。若多聚AC中A的量大大超过C,则Gln的掺入大大多于His。可推断Gln的密码子含2A和lC,而His的密码子含2C和1A。用其它共聚物进行类似实验,也可推断出其它密码子的碱基组成,但不能确定密码子的碱基顺序。

His的密码子可能是CCA、CAC或ACC。

 

6.3.5 核糖体结合技术

在1964年,Nirenberg等建立了aa-tRNA与确定密码子结合实验的破译密码新方法。

在缺乏蛋白质合成所需的全部因子的条件下(如无GTP),特异aa-tRNA可与核糖体-mRNA复合物结合。它并不一定需要长的mRNA分子,三核苷酸就可与核糖体结合。

 

方法:

①合成1个含有3nt的三联体核苷酸(RNA)模拟一个密码子,如UUU。

②准备各种tRNA,如Thr、Phe或Lys的tRNA,并将此密码子所可能隐含的氨基酸(如Phe)用放射性元素标记。

 

③将密码子、tRNA及核糖体一起放入硝酸纤维滤膜。游离的密码子和tRNA会被洗脱而通过滤膜,核糖体无法通过滤膜。但与密码子对应的tRNA能与密码子一起与核糖体结合而留在滤膜上。

④检验滤膜看是否含放射性元素。若有放射性,表明此标记氨基酸(Phe)与此密码子(UUU)对应。否则,二者无对应关系。

⑤合成其他密码子并标记其他氨基酸重复此实验。

 

64个密码子都可按设想的序列合成,但有一些三核苷酸序列与核糖体结合不是很有效,以致无法确定哪一个密码子对应于哪个氨基酸。因此不能确定它们是否能为特异的氨基酸编码。而且用这方法也把一些密码定错了(实际确定了50个密码子)。

 

6.3.6 重复共聚物破译密码

在应用三核苷酸技术的同时,Khorana用有机化学与酶学技术相结合的方法合成了已知顺序的含2、3或4种碱基的共聚物(repeating copolymers)。

蛋白质在核糖体上的合成可以在这些有规律的共聚物的任一点开始,并把特异的氨基酸掺入肽链。

 

用化学方法合成了含9nt的两条互补的脱氧寡核苷酸链d(TAC)3和d(GTA)3。以此为模板,用DNA polⅠ合成长链的DNA。

 

以长链DNA为模板,在RNA pol作用下,若加入GTP、UTP和ATP,便合成多聚(GUA)的RNA链;

若加入CTP、UTP,ATP,便合成多聚(UAC)链。

 

通过此方法可合成各种不同的重复共聚物用于研究密码子。

用重复顺序CUCUCUCU…做模板,翻译生成Leu-Ser-Leu-Ser...或是Ser-Leu-Ser...,根据三核苷酸-核糖体结合技术测定的结果,推断出Leu的密码子是CUC,Ser的密码子是UCU。

用重复顺序UGUGUGUG…做模板,得出Cys与Val交替排列的多肽,推断Cys的密码子是UGU,Val的密码子是GUG。

 

用同样方法,也可测知含3种碱基重复顺序所编码的多肽。

用多聚AAG(AAGAAGAAG…)得出3种多肽:多聚Lys(密码子是AAG)、多聚Arg(密码子是AGA)和多聚Glu(密码子是GAA)。

多聚AUC是多聚Ile(密码子AUC)、多聚Ser(密码子UCA)、多聚His(密码子CAU)的模板。

 

用4个碱基重复顺序,亦可测知不同氨基酸的密码子。

用多聚(UAUC)合成的多肽为Tyr-Leu-Ser-Ile重复顺序的多肽;

用Nirenberg的三核苷酸结合技术和Khorana的重复顺序技术,于1965年将遗传密码全部破译。

 

合成基因

 

1966年破译了所有氨基酸的密码子

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