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7.2 rRNA和核糖体
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:5287    更新时间:2011/4/15
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核糖体(ribosome)是由rRNA和核糖体蛋白组成的亚细胞颗粒,位于细胞质内。

 

 

一类核糖体附着于粗面内质网,参与分泌性蛋白质合成,另一类游离于胞浆,参与细胞固有蛋白质合成。

 

在一个生长旺盛的细菌中大约有20000个核糖体,其中蛋白质占细胞总蛋白质的10%,RNA占细胞总RNA的80%。

核糖体有大、小两个亚基。在原核细胞和真核细胞中核糖体的组成不同。

 

7.2.1 rRNA

原核生物核糖体50S大亚基由23S、5S rRNA和约30种蛋白质构成;30S小亚基由16S rRNA和约20种蛋白质构成。

 

真核生物核糖体60S大亚基由28S、5.8S和5S rRNA以及大约40种蛋白质组成,其中5.8S相当于原核生物23S rRNA 5’端约160nt。40S小亚基由18S rRNA和约30种蛋白构成。

 

不同生物rRNA分子大小相差悬殊,16S类(包括18S)中最大的大于1800nt,哺乳动物的18S rRNA却只有12S,大约950nt。

鼠的28S rRNA长4718nt,而锥虫的28S rRNA却只有1152nt。大小变化的幅度,将由序列分析数据的积累而不断修正。

 

不同大小rRNA分子的二级结构相似,单股rRNA链自行折叠形成螺旋区和环区,螺旋区的碱基保守性较强。

至2000年,已对2460种生物的10700种16S rRNA的序列和分类地位等作过分析。作过序列分析的23S rRNA近千种。

 

原核rRNA修饰的核苷酸有Um、m6A、m1A、m26A、m3U、y等,脊椎动物rRNA中有较多的2’-O-甲基化的核糖和甲基化的碱基以及许多y。但修饰的意义不明,可能与rRNA的折叠以及与核糖体蛋白的结合有关。

线粒体rRNA大小变化很大,无5S rRNA。叶绿体rRNA和细菌rRNA相似,但有4.5S(相当于细菌23S rRNA的5’端96nt)或7S rRNA(相当于23S rRNA的5’端291nt)。有的昆虫有2.5S rRNA,相当于5.8S rRNA的3’端约25nt。

 

a:古细菌16S rRNA

b:酵母16S rRNA

c:牛的线粒体16S rRNA

 

核糖体蛋白对rRNA上结合位点的识别与结合、不同核糖体蛋白之间的识别、联结及组装成为核糖体等细节都处在研究之中。现在只知道彼此所处的相对位置,联结的细节并不完全明确。

 

目前已对16S、23S和5S rRNA的结构域及其在翻译中的作用进行了大量的研究。

每个结构域均含一些茎环结构,rRNA中不配对的碱基可能涉及与其它RNA的结合。

 

如16S rRNA有4个结构域。

3’端的反SD序列和mRNA的SD序列配对,有利于把mRNA带到翻译的起始位点。

 

大肠杆菌16S rRNA的C726突变为G726,则30S亚基和mRNA的亲和力降低、与释放因子RF2的亲和力降低,能读通终止密码子UGA;530环上G517被置换或缺失,提高无义抑制最高达9倍,提高移码最高达6倍;1397~1400nt间的缺失或插入可使核糖体功能完全丧失。

 

16S rRNA的解码区就在3’端,与解码区结构相似的寡核苷酸和天然16S rRNA解码区一样,可对抗生素、tRNA和mRNA作出反应,但解码机制不明。

 

23S rRNA有6个结构域,空间分布很广且结构复杂,其中结构域Ⅴ的中心环对转肽酶活性十分重要。

 

16S rRNA和23S rRNA间的接触位点

 

23S rRNA的G2252和P位tRNA的3’CCA互作;G2553和A位tRNA的CCA互作;23SrRNA形成的三维结构使P-环携带的tRNA与U2585相互作用。

 

7.2.2 核糖体蛋白质

核糖体蛋白和rRNA一样在不同生物中具有同源性。E. coli 30S亚基由21种蛋白(S1~21)组成,50S亚基由34种蛋白(L1~34)组成,它们的氨基酸序列都是已知的,序列的同源性很小。

 

70S核糖体的蛋白组分一般为单拷贝。除过L7,L7是N端乙酰化的L12。只有S20和L26是大小亚基共用的(S20=L26)。S1最大(557aa),L34最小(46aa)。

 

真核细胞40S亚基上有33种蛋白质,60S亚基上有49种蛋白质。

核糖体蛋白,富含碱性残基Lys和Arg,少有酸性残基,这有利于与rRNA的相互作用。

 

 

核糖体蛋白的功能至今仍知之甚少。核糖体蛋白和rRNA的许多位点相互作用,决定了核糖体的结构和性质。E. coli突变株BM108证明L28是组装70S所需;S4、S5和S12都和翻译忠实性有关。

E. coli的L27参与大亚基50S的组装,并且是构成转肽中心的一部分。酵母线粒体核糖体有77种多肽,除Var1p外全部由核编码,翻译以后进入线粒体内。

 

核糖体蛋白在译码过程中的作用。分析枯草杆菌核糖体蛋白突变对噬菌体j29以及E. coli的28种核糖体蛋白突变对噬菌体基因lN和基因lQ表达的影响,表明核糖体蛋白对所要翻译的mRNA有选择性。

 

核糖体蛋白的其他功能。如E. coli的S1是RNA噬菌体MS2、R17、Qb等复制酶的亚基;L14能促进某些噬菌体Rep解旋酶的活性;S12防止T4噬菌体内含子出现非催化结构而促进其自我剪接。

人S3的氨基酸序列和无嘌吟/无嘧啶内切核酸酶Ⅲ(AP endonulease Ⅲ)的氨基酸序列相同,有无嘌吟/无嘧啶内切核酸酶活性,在DNA损伤修复中发挥作用。

 

核糖体蛋白参加核糖体蛋白基因表达的自我调节,如E. coli的S4、S7、S1、L1和L10结合于本操纵子的mRNA、抑制翻译,L4抑制S10操纵子的转录、翻译。

一些核糖体蛋白基因突变引起发育异常。如人S4突变,可患特纳综合征,女性性腺发育不良,各种解剖结构异常。

核糖体蛋白还有其他功能,如非洲爪蟾S8磷酸化后则是卵母细胞外膜蛋白之一,但不磷酸化则为核糖体上的S8。

 

30S小亚基与大亚基结合面观

 

7.2.3 核糖体的结构

利用电子显微镜术、免疫学方法、中子衍射技术、双功能试剂交联法、不同染料间单态-单态能量转移测定、活性核糖体颗粒重建等方法。完成对E.coli核糖体52种蛋白质氨基酸序列及三种rRNA一级和二级结构的测定。

 

核糖体RNA暴露在亚基表面

 

7.2.3.1 核糖体的大小和形状

30S亚基为扁平不对称颗粒,大小为5.5×22×22nm,由头(占1/3)和体(占2/3)组成,头和体间的部分是颈,并有1-2个突起称为叶或平台。

 

50S亚基呈三叶半球形,大小为11.5×23×23nm。rRNA主要定位于核糖体中央,蛋白质在颗粒外围。

大亚基由半球形主体和三个突起组成。中间突起(鼻)是5SrRNA结合之处,两侧突起分别称为柄(stalk)和脊(ridge)。柄含L7和L12;脊含L1,脊又称L1肩(L1 shoulder)。

 

70S核糖体直径约22nm。小亚基斜(45°角)卧在50S亚基的L1肩和中心突之间。

 

 

7.2.3.2 核糖体的体外人工重建

核糖体亚基的自我装配(self-assembly)过程不需其它任何因子参与,只要把rRNA和相应的蛋白质加入反应系统即可自动装配。

 

①小亚基的装配

大约2/3的30S蛋白质在较低温度条件下与16SrRNA结合,形成一个沉降系数为21S的中间颗粒。当温度上升到37℃后,中间颗粒物经构象变化沉降系数由21S转变为26S。同时产生一些新结合位点,其余1/3的蛋白质在较低温度条件下与26S颗粒结合成完整的30S亚基。

 

②大亚基的装配

低温下由23S和5S rRNA以及大约2/3的50S蛋白质组成33S颗粒。当温度上升到44℃时,沉降系数从33S增至41S(颗粒的构象紧缩)。41S与另一些蛋白质结合转变为48S。把温度上升到50℃,48S转变为有活性的50S大亚基。

 

 

 

7.2.3.3 核糖体的有关位点

rRNA与蛋白质共同构成的核糖体功能区是核糖体表现功能的重要部位。

①A位点(Aminoacyl-tRNA site)

是结合新进入的AA-tRNA的位置。即AA-tRNA位或受位。它大部分位于大亚基而小部分位于小亚基。

②P位点(peptidyl-tRNA site)是结合起始tRNA并向A位给出氨基酸的位置。又称肽酰-tRNA位或给位。它大部分位于小亚基,小部分位于大亚基。

③E位点(exit site)为脱酰基–tRNA释放位点。

④mRNA结合位点位于大、小亚基的结合面上。

 

 

7.2.4 蛋白因子

蛋白质合成是以核糖体为翻译场所。tRNA为译员,同时翻译的起始、延伸和终止过程各自都要有蛋白因子的协助。

 

7.2.4.1原核中参与翻译的蛋白因子

①原核生物的起始因子有IF1、IF2和IF3。

 

IF2·GTP协助fMet-tRNAiMet进入P位,是翻译起始的关键一步。IF2具有GTP酶活性,GTP的水解是形成大小亚基复合体所必须的。

 

IF1保护16S rRNA上的G529,G530,A1429和A1493碱基,这些碱基也是tRNA与A位结合所保护的,IF1的保护可避免氨酰-tRNA提前进入A位而破坏肽链合成的起始。

IF1也可增加IF2和IF3的活性,并且IF1在核糖体亚基聚合时具有活化GTP酶的作用。IF1有高度保守性。

 

IF3可保护16S rRNA上的G700、G703和G791,这些位点也是50S亚基所保护的,由于IF3在保护,可避免50S亚基的结合,因此IF3如同一个解离因子使闲散的核糖体保持亚基状态。

 

IF3在小亚基上占据的位点即是将来的E位点。

IF3还促进fMet-tRNAiMet但排斥延伸tRNA加入三元起始复合体。

 

②原核生物的延伸因子有EF-Tu、EF-Ts和EF-G。

 

EF-Tu负责把aa-tRNA植入核糖体的A位。EF-tu为单体G蛋白,与GTP结合后可与aa-tRNA结合形成aa-tRNA·EF-Tu·GTP复合物。

 

氨酰-tRNA通过两个阶段进入A位。首先反密码子的端部与30S亚基A位结合。然后密码-反密码识别引起核糖体构象变化,使tRNA结合更稳固,并引起EF-Tu将GTP水解。此时tRNA的CCA尾部进入50S亚基的A位。EF-Tu-GDP被释放。

 

EF-Ts参与EF-Tu·GDP转变成有活性的EF-Tu·GTP形式,EF-Tu·GTP才能与氨酰-tRNA结合。

 

EF-G具有GTPase活性,利用GTP水解的能量使核糖体构象改变而引起转位。

 

并非EF-G将肽酰tRNA由A位推到P位

 

EF-G结构与aa-tRNA·EF-Tu·GTP复合物类似,EF-tu及EF-G与核糖体的结合是相互排斥的。

 

③原核生物释放因子有RF1、RF2和RF3。

RF1识别UAA、UAG,RF2识别UAA、UGA。RF1和RF2序列相似。

RF1的Arg137→Pro突变体43℃温度敏感,能读通UAA、UAG;而L7/L12的Glu82→Lys突变能抑制此突变表型,说明RF1和L7/L12相互作用。

 

用胰凝乳蛋白酶切去RF1的C端,则失去肽酰tRNA的离体水解活性,但加强离体结合核糖体上终止密码子的活性。增强了与核糖体的亲和力。所以RF的作用有点像tRNA,参与解码和转肽,但RF解的是无义密码子;tRNA的转肽是把肽酰tRNA转给A位的aa-tRNA;RF无法接受转来的肽酰tRNA,引起翻译终止。

 

RF3无密码子特性,不单独起终止作用,有加强RF1和RF2的作用。

RF3是GTP结合蛋白(G-protein),结构与EF-Tu和EF-G相似。当终止密码子进入A位时,无相应的aa-tRNA来阅读,只有RF1或RF2结合,RF3促进RF1或RF2水解肽酰tRNA的活性把多肽释放出来,RF3失活的细胞,翻译仍能终止,但生长不能达到最适水平。

 

原核生物中存在核糖体释放因子(ribosome release factor,RRF)或核糖体循环因子(ribosome recycling factor,RRF),它促使核糖体脱离翻译完成的mRNA,以便重新执行翻译任务。

 

RRF的作用需要EF-G和IF3的作用,RRF有类似tRNA结构,它作用与50S亚基,使核糖体亚基解离。而IF3保留防止亚基再结合。

 

7.2.4.2真核中参与翻译的蛋白因子

真核生物翻译起始因子、延伸因子和细菌的相似,但真核生物起始因子eIF为数较多,有些有亚基结构。

①起始因子eIF

已发现的真核起始因子(eukaryote initiation factor, eIF)有12种左右。

 

 

eIF1是单肽,15~22kD,使40S亚基和60S亚基各自独立,使Met-tRNAMet和40S稳定结合成为43S并促进mRNA加入,组成翻译起始复合体。

eIF2和原核生物的IF2功能相似,但结构不同,有a、b、g亚基,其中b(g)结合Met-tRNA和GTP。eIF2和Met-tRNAMet、40S结合形成43S,并负责识别起始密码子AUG。

 

eIF2B又称GEF(鸟核苷酸互变因子)。由5个亚基构成,负责eIF2的GTP循环。

 

eIF3是相对分子质量达600~650kD的多亚基因子。eIF3是解离因子,和40S结合使它暂不与60S结合。由于eIF3和eIF4F的亚基eIF4G互作,对组装前起始复合体起关键作用。

eIF4F有3个亚基(eIF4G、E和A),其eIF4E亚基能识别和结合mRNA的5’帽子。

 

eIF4G在起始复合体上连接其它成分。酿酒酵母eIF4G中部可能有RNA结合位点,并在N端鉴定到poly(A)结合蛋白Ⅰ[poly(A) binding proteinⅠ,PABPⅠ]的结合位点,这对poly(A)尾mRNA翻译的起始有作用。

eIF4A的解旋酶活性可打开mRNA前15nt间的任何二级结构。mRNA的进一步解旋需要eIF4B的参与。

 

eIF5和48S起始复合体(40S·mRNA·eIF3·Met-tRNAMet·eIF2·GTP)结合,水解GTP,促进40S和60S联合,释出eIF2·GDP。

eIF6是和60S亚基结合的解离因子。

 

②延伸因子为EF1、EF2和EF3。

EF1分为EF1a和EF1bg。EF1a相当于原核生物的EF-Tu;EF1bg相当于原核生物的EF-Ts。EF1a高度保守。

EF2相当于原核生物的EF-G。EF2也很保守。

EF3存在于酵母和某些真菌中,对40S亚基起某种作用。

 

③真核生物的释放因子有eRF1和eRF3。

eRF1与原核生物RF并不同源,而和TrpRS﹥90%同源。

eRF1对3种终上密码子都起作用,终止需GTP而eRF1无GTP结合结构域,所以不能直接利GTP,只能低效使翻译终止,但eRF3有GTP结合基序,eRF1和eRF3合作,由eRF1识别终止密子,eRF3水解GTP,由于eRF1无法接受由P位转肽过来的肽酰tRNA,只能停止翻译。

 

在真核生物细胞质中还没有发现与原核生物RRF对应的蛋白质因子(线粒体有RRF)。也许eRF3兼有原核RF3和RRF的功能,如同eRF1兼有RFl和RF2的功能一样。原核生物缺RF3是可以生存的,真核生物缺eRF3却是致死的。

 

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