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8.1 常用DNA操作技术
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:3704    更新时间:2011/4/15
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8.1.1 核酸电泳

根据核酸分子大小选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作支持物制胶板→点样→电泳→染色→照相或扫描

 

 

 

用溴化乙锭(ethidium bromide, EB)染色的核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA条带

 

Golden view

 

 

 

 

 

 

 

限制酶切图谱(DNA物理图谱)

用限制酶消化DNA分子后经凝胶电泳分离,根据电泳图谱分析确定各种限制酶切位点在DNA上的相对位置,即可绘制出一幅完整的限制酶切点图谱。

 

酶切作图时,先选择某种对DNA分子只有一个切点的酶进行切割,并以此切点为起点,然后进行适当组合的双酶切和多酶切,根据各种酶切所得DNA片段的大小及变化,即可推测并确定各切点的相对位置。

 

对于重组DNA分子,可用识别序列为4个碱基的限制酶组合进行切割,经电泳测量片段大小作出精细结构图。

获得限制性图谱的作用:进一步证实转化体中含有重组DNA分子以及外源DNA片段插入的特定位置。为重组分子的进一步鉴定提供可靠的依据。

 

RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)

原理:RFLP是了解基因细微结构及其变化的一种方法。如果两个DNA分子完整相同,用同种限制性内切酶在相同的条件下消化,所得的限制性内切酶谱相同。如果两个DNA分子基本相同,只在一处或几处发生某种变异,就是很小的差异,消化后两DNA分子的限制性酶谱的条带方式不同,即产生多态性。对这些条带分析可获得两种DNA分子结构差异的信息。

 

RFLP也可用来研究基因突变和基因转化。例如某限制酶对一DNA片段有A、B、C三个切点,完整消化后电泳出现四条带,若该片段中有外源基因插入,插入部位没有影响酶切位点,并且插入的片段中也无该限制酶的切点,那么谱带数与原来相同,但有的条带的迁移率将出现差异,即产生多态性;

 

若插入位置正好在酶切位点上,则条带减为三条,度出现迁移率的变化;若插入的外源基因内有一个该限制酶的切点,且没有影响原来酶切位点,则条带增为五条,这三种情况都发生了多态性。

若未发生转化,则条带数目及迁移率与原来相同,无多态性出现。

 

SNP(single nucleotide polymorphism)

SNP是在基因组水平上由于单个核苷酸的变异而产生的一种DNA序列多态性。这种单核苷酸变异包括单碱基的转换和颠换。

 

变性梯度凝胶电泳检测SNP:异源DNA双链与同源DNA双链由于熔解温度Tm值不同,从而在分子稳定性或单链构象上也不会完全相同,据此,利用变性剂的浓度梯度凝胶电泳来进行分离检测。分别具有一种SNP等位基因型的两种DNA分子之间即使只有一个碱基对的差异,也会在不同时间发生部分解链,从而分离成两条带。

 

凝胶阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)

EMSA是利用电泳分析蛋白质与DNA相互作用的技术。

原理:蛋白质与DNA结合后分子质量将增加,在电泳中移动的速率减小,没有结合蛋白的DNA片段迁移速率大。利用这一原理可分离纯化细胞提取物中特定DNA结合蛋白。

 

在EMSA中可用放射性同位素标记的DNA片段与细胞提取物共温育,在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。放射自显影技术显现标记DNA条带位置。根据位置判断细胞提取物中是否存在DNA结合蛋白。

 

8.1.2 核酸序列分析

测序策略:测定含有靶DNA随机片段的序列,利用计算机排列每个序列在靶DNA中的位置。

 

8.1.2.1 双脱氧链终止法

1977年Sanger发明双脱氧链终止法测定单链DNA的序列。

原理:①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板,合成准确的DNA互补链;②该酶能够用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3’-末端,从而终止其延伸反应。电泳分离反应产物,读出基因的序列。

 

在DNA测序反应中,加入模板DNA、引物、DNA聚合酶(常用Klenow大片段,无5’→3’外切酶活性)、dNTP,在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddNTP,结果将产生4组寡核苷酸,它们将分别终止于模板链的每一个A、G、C或T的位置上。电泳分离读序。

 

8.1.2.2 化学修饰法

Maxam-Gilbert法利用对DNA化学降解测序。通过对末端标记的DNA片段在4组独立的化学反应中分别进行部分降解,其中每一组反应特异地针对某种或某一类碱基。因此生成4组放射性标记的分子。每组混合物中均含有从标记端到降解位点长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。反应后进行电泳分离放射自显影来检测末端标记的分子。

 

此方法成败的关键取决于降解反应的特异性。第1步先对特定碱基进行化学修饰,而第2步修饰碱基从糖环上脱落,修饰碱基5’和3’的磷酸二酯链断裂。

 

①G反应:用硫酸二甲脂使鸟嘌呤上的N7甲基化,其糖苷键在中性加热条件下脱落

②G+A反应:先用甲酸使N质子化再用哌啶使嘌呤脱落

③T+C反应:用肼使嘧啶开环,哌啶除碱基

④C反应:在NaCl存在时肼只与C反应,不与T反应,哌啶除碱基,并使磷酸二酯键断裂。

 

比较G、A+G、C+T、和C各个泳道,从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA序列。

 

 

8.1.2.3 DNA序列分析自动化

用荧光剂标记DNA引物(或dNTP),被标记的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应,跑DNA凝胶后用计算机检测(在凝胶装置的底部有由激光源和探测器组成的检测系统)。

 

 

 

8.1.3 聚合酶链式反应及应用

1971年Korana提出核酸体外扩增的设想:“变性DNA与合适的引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

 

1985年Mullis等发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)。在试管中给DNA合成提供:模板DNA,引物,DNA聚合酶,缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期。

 

1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶——Taq DNA Polymerase。Taq酶的特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%。②在热变性时不会被钝化。③可提高扩增片段特异性和扩增效率,增加扩增长度(2.0kb)。

 

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成,2~4min一个循环,2~3hr就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

 

 

标准的PCR反应体系:

10×扩增缓冲液                   10ul

4种dNTP混合物                    各200umol/L

引物                                       各10~100pmol

模板DNA                         0.1~2ug

Taq DNA聚合酶                   2.5u

Mg2+                                          1.5mmol/L

加双蒸水至                               100ul

 

PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。设计引物应遵循的原则:

①引物长度常为20bp左右。

②引物扩增跨度200~500bp。

③引物G+C含量以40~60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

 

④避免引物内部出现二级结构以及两条引物间互补。

⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基应严格配对。

⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。

 

⑦引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

 

Taq DNA聚合酶的生物学活性:

70~80℃         150nt/S/酶分子

70℃                   60nt/S/酶分子

55℃                   24nt/S/酶分子

Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20~85℃,高于90℃时合成很难进行。

 

PCR反应温度与时间的设置:

予变性  94℃                 5~10min

变性      93~94℃         1min

退火      40~60℃         30~60sec

延伸      72℃                 1min

循环      30~40次

末端补平72 ℃             10min

 

一般1Kb以内的DNA片段延伸1min。3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。

 

PCR产物是否为特异性扩增,必须进行分析鉴定才能得出结论。

凝胶电泳分析:PCR产物经电泳分离,产物片段的大小应符合预计的大小。

 

酶切分析:根据PCR产物中限制性内切酶切位点,酶切后电泳分离,应获得符合理论的片段。

分子杂交:检测PCR产物的特异性。

核酸序列分析:是检测PCR产物特异性的最可靠方法。

 

实时定量PCR

 

随机扩增多态DNA(Randomly Amplified Polymorphic)分析

RAPD是利用PCR技术从扩增的DNA片段上分析多态性。由于被引物选择地扩增,并不是所有序列都扩增,扩增了的片段能在凝胶上清晰地显示出来,这样就可通过同种引物扩增条带的多态性反映出模板的多态性。

 

RAPD是以PCR技术为基础,利用一系列(通常数百个)随机引物(通常为10mer)对所研究的DNA进行PCR扩增,分析扩增片段的多态性,以反映基因组相应区域的DNA多态性。

因此,基因组在扩增区域发生突变就可能导致PCR产物的改变。通过检测即可检出基因组DNA的多态性。

RAPD可在对被检对象无任何分子生物学资料的情况下进行分析。

 

不同月季品种的RAPD(郭立海,2002)

 

RT-PCR:mRNA的提取分离、逆转录和扩增

 

 

 

Differential display

 

差异显示分析:mRNA→cDNA(3’端用锚定引物,5’端用20条随机引物扩增)→酶切→加接头(分两组,加不同的接头)→

 

锚定引物序列:

5’-ACGACTCACTATAGGGCT11~12MN-3’

M不为T,N任意,MN共有12种组合方式。

随机引物序列:

5’-ACAATTTCACACAGGACGACTCCAA-3’

5’-ACAATTTCACACAGGAGCTAGCATG-3’

5’-ACAATTTCACACAGGAGACCATTGC-3’

5’-ACAATTTCACACAGGAGCTAGCAGA-3’

5’-ACAATTTCACACAGGAATGGAAGTC-3’

5’-ACAATTTCACACAGGATACAACGAG-3’

 

→ 不同接头的Tester/Driver=1:100混合→变性→杂交→

 

PCR(引物序列和接头相同)→检测

 

若Tester与Driver序列同源则呈线性扩增(电泳无法检测),否则呈指数扩增。

 

 

SMART技术:Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Transcript

在合成cDNA反应中加入的3’末端带Oligo(dG)的SMART引物,MMLV反转录酶到达mRNA模板的5’端 “帽子” 时会在cDNA末端加几个(dC),SMART引物的Oligo(dG)与cDNA末端的C配对,逆转录酶会转换以SMART引物为模板延伸cDNA链至引物末端。

 

得到的cDNA单链一端有含Oligo(dT)的起始引物序列,一端为SMART引物序列,合成第2链后可利用通用引物进行扩增。

 

由于有5’帽子结构的mRNA才能利用此反应得到能扩增的cDNA,因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。

得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度,可应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA(RACE),和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。

 

8.1.4 基因组文库的构建

基因组文库(genomic library)是将某种生物细胞的整个基因组DNA切成适当长度的片段,连接在载体上,转化到宿主细胞中而构建的克隆总体。

理论上这些重组子应包含有整个基因组DNA序列。构建基因文库的目的主要是为了直接从基因组中分离(钓出)目的基因。

 

从概率原则来看,只有当文库中重组子总数达到某一数值时,才能包含基因组中的所有基因。构建完整基因组文库所需的重组子数目,主要取决于基因组的大小和目的基因片段的大小两参数。

 

1975年Clarke和Carbon提出了计算重组子数目的公式:

N=ln(1-p)/ln(1-f)

N:所需重组子数目;

p:选出某一基因的概率;

f:单个重组子中插入片段平均大小与基因组DNA总量之比;

 

对于某一特定基因组,构建成其DNA文库所需的重组子数目基本上取决于所用载体的容量大小。

构建高等生物基因组DNA文库时,通常采用l噬菌体载体,其克隆容量大(约为24kb),可减轻克隆和筛选大量重组子的工作量。

 

应用l噬菌体载体构建基因组文库的程序:

①用适当的限制性内切酶消化基因组DNA,以得到约20kb的片段;

②用限制性内切酶切割载体DNA,使其形成与外源DNA相匹配的粘性未端;

③用适当的方法除去l噬菌体裂解生长非必需的内部片段;

 

④l噬菌体载体臂与外源DNA片段连接;

⑤利用体外包装系统进行噬菌体的组装;

⑥重组噬菌体侵染E. coli,每一克隆中含有外源DNA的一种片段,全部克隆构成一个基因文库。

 

cDNA文库的构建

cDNA文库是一生物的总mRNA为模板,用逆转录酶合成互补的双链cDNA,然后连接到载体上,转化宿主细胞后构建的基因文库为cDNA文库。

如果用某种特异的mRNA(不是总的mRNA),由此建成的克隆则称为该种特异基因的cDNA克隆。

 

以mRNA为模板反转录的cDNA,为真核基因在原核细胞内表达提供了基础。此外cDNA文库比基因组文库要小(一般相差10~100倍),在基因的克隆和筛选方向也具有较大的优势。

 

构建成cDNA文库的基本程序:

①mRNA的提取和纯化。

②合成cDNA第一链。

③将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。

④将双链cDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。

⑤将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。

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