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8.2 分子杂交
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:4311    更新时间:2011/4/15
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核酸分子杂交技术是分子生物学中应用很广的技术,它可以鉴定核酸分子之间的同源性,是分子克隆技术的重要组成部分。

 

8.2.1 探针

探针是一段标记核酸序列,长度在15个核苷酸~1kb,也可以是完整或部分基因。探针可与靶序列互补形成杂交双链,通过检测杂交链信号即可对靶序列DNA的存在及其分子大小加以鉴别。

探针可以是克隆的,也可以是合成的。用PCR扩增产物可制备探针。也可用提纯的质粒进行标记制备探针。

 

探针种类和应用

克隆探针:特异性强,复杂度高,较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列的少,杂交信号强(掺入的可检测标记基团多)、稳定。用于未知序列的测序和绘制酶切图谱。

 

合成寡核苷酸探针:复杂度低、杂交时间短(分子量小)可大量合成,可用酶学和化学法修饰,一般长为18~50nt。可检测点突变,探测cDNA文库,研究蛋白质的编码基因,传染病和遗传病的诊断。

 

cDNA探针:由mRNA反转录而来,无内含子。用于分析内源基因缺陷、外源基因和基因表达的检测。

基因组探针:来源于基因文库,用于筛选所需的含特定基因的重组体,以便次级克隆和测序。内含子序列可用于区别同源性高的基因。

 

RNA探针:直接分离的mRNA、rRNA、病毒RNA或体外转录的RNA。用于反向杂交检测基因的转录状态;检测mRNA的表达水平;rRNA探针用细菌分类。

 

探针标记方法

缺口平移、随机引物、末端加尾、末端标记、逆转录掺入、体外转录、PCR标记等。

末端标记如T4激酶(5’)或脱氧核糖核酸末端转移酶(TDT)(3’)端标记。

 

放射性同位素标记:32P和35S。32P能量高信号强。放射性同位素有辐射危害和半衰期限制(32P半衰期14.3天,35S为87.1天,125I为60天。3H为12.3年,但释放β射线的能量太低,只能用于组织原位杂交)。

非放射性标记物:荧光物质,半抗原如地高辛、生物素,酶类如辣根过氧化物酶(HRP)、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶(AKP)等。

 

生物素标记:将生物素(Biotin)连接在核酸探针上,利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理,分子杂交后用亲和素(Avidin)或链霉亲和素(Streptavidin)进行检测。

亲和素可用酶、荧光素或高电子密度(铁蛋白,胶体金等)的标志物标记。

 

酶促生物素标记技术:生物素与dUTP中尿嘧啶的5位C相连,在聚合酶作用参入DNA。

 

光促生物素标记技术:用光敏生物素(Photobiotin)标记探针。光敏生物素主要有乙酸盐和补骨脂素生物素,其结构由三部分组成:光敏基团、连结臂和生物素。强光下光敏基团可与核酸中的碱基相结合。可用于单链或双链核酸(DNA或RNA)标记。

光敏生物素标记核酸方法简单,但标记效率不高,每100~150nt才能标记一个生物素,对于短的探针不宜使用。

 

地高辛(Digoxigonin)标记:地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连。

碱性磷酸酶使BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)的吲哚环脱下的H还原NBT。

辣根过氧化物酶催化:AH2+H2O2®A+2H2O

A:二氨基联苯胺(BAD,产物为红棕色沉淀)或四甲基联苯胺(TMB,产物为兰色)。

 

荧光素标记:荧光物质异硫氰酸荧光素(黄绿色)、试卤灵(红色)和羟基香豆素(兰色)等。用荧光素标记核酸;用荧光素标记抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。

 

8.2.2 核酸分子杂交

分子杂交(hybridization)是应用核酸分子的变性和复性的性质,使两条来源不同的具有一定同源性(即具有碱基互补关系)的DNA单链分子或DNA单链分子与RNA分子经退火形成双链DNA分子或DNA-RNA异质双链分子(heteroduplex)的过程。

 

杂交双链可以在DNA与DNA链之间,也可在RNA与DNA链之间形成。

杂交首先透过加热或碱处理使双螺旋解开成为单链,然后在一定条件下使互补核酸链实现复性。

 

8.2.2.1 杂交分类

①溶液杂交(solution hybridization)

将不同来源的DNA变性后在溶液中进行杂交。

 

②滤膜杂交(filter hybridization)

硝酸纤维素滤膜可吸附单链DNA或RNA,将变性的DNA或RNA吸附到膜上进行杂交。

印迹法(blotting)是将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

 

8.2.2.2 杂交方法及应用

核酸杂交技术广泛应用于分子生物学、临床医学、细胞生物学、分子遗传学等领域。例如在医学上用于多种遗传性疾病的基因诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的基因分析,传染病病原体的检测等领域中。

① Southern blotting

Southern杂交技术是1975年由英国Southern创建,以其名字命名的分子杂交技术,即将DNA电泳、转印到固相支持物上,用探针(DNA/DNA杂交)进行检测的方法。是基因分离和鉴定的重要手段,广泛用于遗传多态性分析。

 

DNA样品经限制性内切酶消化后,DNA片段在电泳凝胶中分离。

凝胶经变性处理(加碱性缓冲液),使其中的DNA双链分子变性成单链;

 

利用毛细管作用原理将凝胶中的单链DNA分子转移并固定到固相支持物表面上(硝酸纤维素膜或尼龙膜)。

 

此时DNA片段还保留着在凝胶中的分布图式。

 

电泳印迹可更快速有效地进行转移。用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”形状,而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳,选择适当的电泳方向就可使DNA离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。

 

真空转移:将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。

优点:快速,在30min内就能从普通琼脂糖胶板(厚4~5mm,浓度<1%)中转移出来,杂交信号比Southern转移(毛细管)强2~3倍。

缺点:易使凝胶碎裂,且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。

 

Southern分子杂交技术灵敏度很高,可以检测出相当于人的基因组中只出现一次的DNA序列(10-6)。它与绘制的DNA物理图谱相结合,可以确定目的基因在图谱中的位置及其限制性酶切点位置。

 

②Northern blotting

由于与Southern分子杂交技术类似而得名。

mRNA样品经电泳分离后,转移到硝酸纤维素膜(或叠氮化活性滤纸,尼龙膜)上,与放射性标记的DNA探针进行杂交,经放射自显影,即可检测特异性mRNA分子在样品中存在与否,及其长度大小和量的多少。

 

与Southern分子杂交技术不同之处:Northern分子杂交技术用于检测特异性mRNA的存在。转膜不需变性。

用于研究特异性mRNA分子在细胞处于不同条件下发生量和质的变化,或不同组织器官中基因表达的差异。

③Western blotting

蛋白质印迹技术是1975年Southern建立了Southern印迹法后,人们用类似的方法对蛋白质进行印迹分析,称为Western印迹法。

蛋白质经单向电泳后分离后被转移到硝酸纤维滤膜上,然后用放射性或酶标记的特异抗体来检测相应抗原的存在。

 

将电泳后分离的蛋白质通过毛细管印迹法或电泳印迹法从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上。转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹(blot),用于对蛋白质的进一步检测。

 

印迹先用蛋白溶液(如10%的BSA)封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点,后用目的蛋白质的抗血清(一抗)处理,印迹中只有目的蛋白质与一抗结合,清洗去除未结合的一抗后。

再用标记的二抗与一抗结合,可指示一抗的位置,即是目的蛋白质的位置。

 

常用的有酶连的二抗和标记的二抗两种。

酶连的二抗:印迹用酶连二抗处理后,再用适当的底物溶液处理,当酶纯化底物生成有颜色的产物时,就会产生可见的区带,指示目的蛋白质的位置。

例如,碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

 

碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物。

 

 

辣根过氧化物酶以H2O2为底物,将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。

也可用增强化学发光法检测辣根过氧化物酶,辣根过氧化物酶在H2O2存在下,氧化化学发光物质鲁米诺(luminol,氨基苯二酰一肼)并发光,在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍,通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

 

其他标记二抗指示剂:

荧光素异硫氰酸盐标记的二抗可以通过在紫外灯下产生荧光来检测。

I125标记金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A),Protein A可以与Ig G的Fc区特异性的结合,因此Protein A可以代替二抗:I125标记的Protein A通过放射性自显影检测。

 

金标记的二抗:二抗通过微小的金颗粒包裹,与一抗结合时可以表现红色。

过氧化物酶标记的凝集素处理。生物素可以与凝集素紧密结合,这种方法实际上相当于通过生物素与凝集素的紧密结合将二抗与酶连接,通过酶的显色反应就可以进行检测。优点:一个抗体上可以结合多个生物素,即可结合多个酶连接的凝集素,可增强显色反应的信号。

 

除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外,有时也使用其它探针如放射性标记的DNA,可以检测印迹中的DNA结合蛋白。

④Eastern blotting

Eastern blotting是Western blotting的变形,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

⑤dot blotting

斑点杂交是将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。

 

同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。

 

优点:简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。

缺点:由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。

⑥In Situ Hybridization

原位杂交是将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。

通过原位杂交确定杂交体在样本中的原来位置。包括原位菌落(或噬菌斑)杂交、Northern原位杂交和Southern原位杂交等三种意义上的原位杂交。

 

原位杂交以标记的外源基因为探针,在适宜的条件下,探针与固定在玻片上的细胞内变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体,然后根据探针标记的性质进行检测,放射性同位素标记的探针用自显影检测。酶标记探针通过显色反应检测。

程序:材料预处理、细胞固定、细胞的Rnase(或Dnase,Northern杂交)酶解(降解RNA,减少非特异性杂交)、染色体变性(NaOH)、杂交、检出5个程序。

 

特点:原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究,不需从组织或细胞中提取核酸,对含量极低的靶序列灵敏度高。能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。

 

原位菌落(或噬菌斑)杂交

这是从大量重组克隆中筛选和鉴定目的克隆的有效手段。

1975年Grunstein等提出了在硝酸纤维素膜上原位裂解细菌菌落,并使释放出的DNA非共价结合在滤膜上,进而与相应的放射性标记的核酸分子探针进行杂交的方法。用这种方法能迅速地从数百个菌落中鉴定出含有目的DNA序列的菌落。

 

1980年Hanahan等对此方法进行改进后,可以同时筛选数十万个菌落,提高了检测效率。因此该方法也就成为筛选基因组文库和cDNA文库的有效手段。

原位菌落杂交的基本程序是:先将转化菌落影印到硝酸纤维素滤膜上并铺到琼脂平板表面培养(母板要保存好),待滤膜上长出菌落后取出,用碱或加热使菌落裂解,DNA变性,80℃烘烤(2h)使变性DNA固定在滤膜上。

 

然后用放射性标记的DNA或RNA探针同滤膜上的固定的DNA进行杂交,经放射自显影,与探针有同源性的DNA序列即可在X线底片上形成光点。显然,提供这种DNA的菌落包含有目的DNA序列,可从保留的母板上相应位置挑出所需的阳性菌落。

 

原位噬菌斑杂交适用于噬菌斑的筛选,操作程序是:将硝酸纤维素滤膜覆盖在培养皿表面,使噬菌斑和滤膜直接接触,并按原来的形状和分布影印到滤膜上,经碱变性、固定,然后与探针杂交。

优点:从一个母板上很容易得到几张含有同样DNA印迹的滤膜,可进行重复筛选,增加筛选的可靠性,同时也使用一系列不同的探针对一批重组体进行多轮筛选。

 

原位杂交最大的优点是使用上的普遍性,因为这种方法不要求插入序列的表达,只要有适当的核酸杂交探针,任何DNA序列均可用此法检测。

 

组织细胞的原位杂交

 

Northern原位杂交

在细胞、组织切片上直接进行分子杂交,通过检测细胞内特异mRNA的存在与否来了解哪些细胞中有特异基因的表达。

 

Southern原位杂交

通过杂交来确定外源基因在染色体上的位置。它是基于处于细胞分裂过程中的染色体可用光学显微镜观察到,并可通过染色体的形状以及经不同染色后形成的条带分布来对各染色体进行鉴别和分析。

 

人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片

 

⑦PCR-Southern杂交

PCR-Southern杂交是近年来开始使用的检测外源基因整合的方法。

先对被检测的材料进行外源基因的PCR扩增,然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。

 

Southern杂交的灵敏度很高,可以检测出1pg的单考贝外源基因,但实际上往往达不到此检出量,主要是因为Southern对样品DNA的纯度要求较高,未经纯化的样品杂交效果不理想,另外Southern杂交需要的样品量较大(5~15mgDNA),转化材料少的情况下不能及时检测。利用PCR-Southern杂交可以弥补这两点。

⑧Southwestern blotting

DNA与蛋白质的体外吸附技术(Southwestern blotting)结合了Western印迹与southern印迹两种实验方法的特点而设计的一种检测序列特异性DNA结合蛋白的实验方法,用以研究DNA和蛋白质的相互作用,将PAGE后的蛋白质分子,通过电泳转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上,然后用同位素标记的DNA探针进行吸附,这样与DNA有亲和作用的蛋白质条带便可显示出放射自显影条带。

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