· 用户注册 · 设为首页 · 加入收藏 · 联系站长 · · ·
 | 网站首页 | 文章中心 | 图片中心 | 影音在线 | 下载中心 | 许愿祝福 | 我要投稿 | 
您现在的位置: 生物小吧 >> 文章中心 >> 高校教程 >> 生物化学与分子生物学 >> 正文 今天是:
8.3 分子克隆技术
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:4353    更新时间:2011/4/15
         【字体:

 

8.3.1 基因的大规模克隆

随着动植物基因组全序列测定,识别的开放读码框大量增加,为了了解基因的功能,需要把不同的开放读码框连入各种载体,进行蛋白表达、抗体制备、寄主细胞或植物转化、表型分析、细胞内定位以及目的蛋白与其他分子的相互作用等后续研究。

 

 

Gateway基因大规模克隆法利用l噬菌体进行位点特异性DNA片段重组,实现了不需要传统的酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移,为大规模克隆基因组注释的开放读码框提供了保障。

 

Gateway克隆技术包括TOPO反应和LR反应。

TOPO反应:将目的基因PCR产物连入Entry载体,载体上的CCCTT被拓扑异构酶识别切割,酶通过其Tyr274与切口处的磷酸基共价相连。

 

加入PCR产物后,形成的3’突出端GTGG,攻击PCR产物的互补性末端并与接头序列CACC退火,切去GTGG后使PCR产物连入Entry载体。

 

 

LR反应用于将目的片段从Entry载体中重组人表达载体。

Entry载体上基因两端具有attL1和attL2位点,目的载体上含有attR1和anR2位点,在重组蛋白的作用下发生定向重组,形成新的位点attB1和attB2,将目的基因转移到表达载体中。

 

8.3.2 基因敲除(gene knockout)

基因敲除是通过DNA定点同源重组,改变基因组中的某一特定基因,在生物活体内研究该基因的功能。

胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)可在体外被无限期地培养,并分化成多种类型的细胞。1998年已建立小鼠ES细胞系,并诱导出神经胶质细胞、心肌细胞和肝细胞。

 

打靶载体

新霉素(neomycin, Neo)阳性筛选标志

HSV-tk阴性筛选标志:单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)

 

完全基因敲除

程序:打靶载体的构建→打靶载体导入ES细胞(重组置换)→基因敲除ES细胞注射入胚泡→胚泡植入假孕小鼠的子宫中→嵌合体的杂交育种

 

原理:构建含有一段与靶基因同源序列(10~15kb)的载体,该序列的一个外显子插有抗新霉素基因neor为正选择标志,在此序列3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因为负选择,HSV-tk基因由邻近的neor基因启动子调节。

 

将重组体导入ES细胞并体外培养,以新霉素和致死核苷类似物(gancyclovir)双重筛选。随机插入的DNA通常以从头至尾整合入受体DNA中,HSV-tk+表达可使gancyclovir转变成有毒物质引起细胞死亡。若发生同源重组,由于tk基因在同源区之外不能整合,neor基因在同源区之内得以保留,这样受体细胞抗G418有正选择作用,对gancyclovir无转变功能而有负选择作用,因此存活细胞是与导入基因发生同源重组的。

 

 

条件性基因剔除:对于重要功能基因进行完全基因敲除会导致胚胎死亡,影响基因功能研究。因此常用Cre/LoxP和FLP/FRT系统进行组织特异性敲除。根据实验需要,设计在不同发育时期、不同的空间任意敲除任何一个靶基因。

 

①构建条件型基因敲除打靶载体,将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中,并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向LoxP位点。

 

②需要消除靶基因活性时,与带有Cre重组酶基因的ES细胞杂交,Cre可把两个LoxP位点间的DNA片段切除,导致靶基因失活。也可用Cre表达质粒转染中靶ES细胞,通过重组将两个LoxP位点间序列删除(包括neo基因)。

 

农杆菌介导的基因转移

Ti质粒(tumor-in-ducing plasmid)转移DNA (transfer DNA, T-DNA)

植物基因敲除株系筛选:T-DNA插入失活进行植物基因敲除。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化,将一段带有报告基因的序列标签整合到基因组DNA上,如果它插入到目的基因内部或附近,就会影响其表达,从而使该基因“失活”。

 

利用PCR可以筛选出基因敲除株系。

T-DNA无专一整合位点。

 

8.3.3 基因的定点诱变

定点突变(site-directed mutagenesis)是通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列,用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响,也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。

 

寡核苷酸介导的DNA突变:含错配的寡核苷酸与目的序列退火;聚合酶延伸及连接酶连接;转化;分离RFDNA。

 

 

重叠延伸介导的定点突变:诱变引物扩增出两种靶片断→退火→末端补平→扩增

 

大引物诱变法:正反(突变)向突变引物扩增→产生大突变引物→与野生型DNA和正向引物混合→退火→PCR

 

 

 

8.3.4酵母单杂交法

酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用。

酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质,可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用,并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。

 

酵母单杂交原理:将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter,Pmin)上游,把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain,AD)融合表达载体导入细胞,该基因产物如果能够与顺式作用元件结合,而激活Pmin启动子使报告基因表达。

 

酵母单杂交体系主要用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因,验证反式转录调控因子的DNA结合结构域,准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。

 

8.3.5 酵母双杂交体系

酵母双杂交体系(Two-hybrid system)是用于分离与已知靶蛋白质相互作用基因的方法。

细胞起始基因转录需要有转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的,这些因子一般由2个或2个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain,DB)和转录激活结构域(AD)是转录激活因子发挥功能所必需的。

 

不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的GAL4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍可结合到Gal4结合位点并激活转录。

 

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。

主要有二类载体:含BD的载体和含AD的载体。

 

二类载体在构建融合基因时,测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达,其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列。

常用BD基因有:GAL4(1-147)、LexA (E. coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。

常用的AD基因有:GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

 

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株是经改造的含报道基因(如lacZ)的重组质粒的宿主细胞。

 

因此,如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成融合蛋白的形式表达并定位于核中,X与Y间的相互作用就可将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列(upstream activation sequence,UAS)结合,发挥激活转录功能使受调控的报告基因表达。

 

双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。

 

 

文章录入:admin    责任编辑:admin 
  • 上一篇文章:

  • 下一篇文章:
  • 发表评论】【加入收藏】【告诉好友】【打印此文】【关闭窗口
    网友评论:(只显示最新10条。评论内容只代表网友观点,与本站立场无关!)
    生物小吧