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8.4 基因表达研究技术
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:2992    更新时间:2011/4/15
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8.4.1 SAGE(serial analysis of gene express)

一段来自于任一转录本特定区域的“标签”(Tag),即长度仅9-14bp的短核苷酸序列,就已包含足够的信息来对应于特定的转录本。例如9nt序列的排列组合有49=262144种,据估计人类基因组仅编码30000种转录本,因此理论上每个9碱基标签就能够代表一种转录本。

 

如果将短片段标签相互连接形成长的DNA分子,则对该克隆进行测序将得到大量连续的单个标签,并能以连续的数据形式进行处理,这样就可对数以千计的mRNA进行批量分析。

各转录本的表达水平可以用特定标签被测得的次数进行定量。

 

SAGE技术的原理和操作步骤

①以biotin-oligo dT为引物将mRNA反转录合成双链cDNA,经锚定酶(Anchoring Enzyme, AE)酶切后收集cDNA的3’端部分。

 

锚定酶通常为识别4碱基位点的III类限制性内切酶,如Nla Ⅲ、Sau3AⅠ等。由于大多数mRNA的长度要大于44=256个碱基,因此使用这种锚定酶可以保证在每一个转录本上至少有一个酶切位点。

 

②将收集的3’端cDNA等分为两部分,分别同接头A、B相连接。每一种接头的结构都由PCR扩增引物A或B的序列、标签酶识别位点和锚定酶识别位点三部分组成。

标签酶(Tagging Enzyme, TE)是一种IIS类限制性内切酶,如BsmF I等,它在距识别位点下游约20bp的位置切割DNA双链。

 

③连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补平5’突出端,得到两组分别带有接头A、B的短cDNA片段(约50bp)。混合并连接两组短cDNA片段,形成一个约100bp的双标签体(ditag)群,并以引物A和B对其进PCR扩增。

 

④用锚定酶切割扩增产物,分离纯化去除接头后的双标签体(约26bp),并使之相互连接成为大片段的连接体,克隆至质粒载体内形成一个SAGE文库以备集中测序。

 

⑤对测序得到的标签数据进行分析处理。在所测得序列中的每个双标签体之间由锚定酶序列相间隔,一般一个测序反应的结果可得到约20个双标签体,亦即包含了约40个转录本的信息。

 

由于双标签体的长度基本相同,不会产生PCR扩增的偏态性;同时数量和种类极大的转录本群体使得由同两个标签重复连接成双标签体的可能性极小,因此通过计算机软件的分析统计能够相当精确地得到上千种基因表达产物的标签序列及其丰裕度。

 

对于在已知的数据库中找不到相同序列的标签,还可以利用约13个碱基的寡核苷酸探针(锚定酶识别位点+标签序列)对cDNA文库进行筛选,以寻找新基因。SAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异(可精确到每个细胞中大约有多少拷贝),可建立较全面的基因表达谱,系统地分析基因表达的差异。

 

8.4.2 RNA干涉

RNA分子一直被认为是小角色。它从DNA那儿获得自己的顺序,然后将遗传信息转化成蛋白质。然而,一系列发现表明这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于DNA,从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。

 

双链RNA(dsRNA)对基因表达的阻断作用被称为RNA干预(RNA interference, RNAi)。双链RNA(dsRNA)经酶切后会形成很多小片段,siRNA(short interference RNA)和miRNA (microRNA)。siRNA一旦与mRNA中的同源序列互补结合,会导致mRNA失去功能,即不能翻译产生蛋白质,也就是使基因“沉默”了。

 

1990年Jorgensen等为加深矮牵牛花的紫色,导入了一个强启动子控制的色素基因。可结果使许多花瓣颜色呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了,Jorgensen把此现象称为共抑制(cosuppression)。

 

1995年康乃尔大学的Su Guo在试图阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par-1基因时,本想利用反义RNA阻断par-1的表达,而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA(sense RNA)以观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。他们对此结果百思不得其解。

 

1998年华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello证实Su Guo遇到的正义RNA抑制基因表达的现象,以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA引起的。

 

将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反,能够高效特异性阻断相应基因的表达。这一现象称为RNA干扰(RNA interference, RNAi)。

1999年RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。

 

2002年,Zernicka-Coetz等用dsRNA注射小鼠受精卵和着床前的胚胎,结果发现导入的dsRNA可特异性的抑制C-mos、E-cadherin和GFP基因的表达。Judy Lieberman和Premlata Shankar首先宣布了在动物中利用RNAi技术治疗疾病的研究进展。

 

作用机理

动植物和人体的病原体中有一些是RNA病毒,如HIV和SARS的冠状病毒。当病毒入侵,转座子(TE)转录或基因组中反向重复序列转录时,细胞中的RNA可结合成分子间dsRNA,也可以通过RNA链自身回折形成分子内dsRNA。

 

dsRNA进入细胞后可在Dicer酶(具有RNase Ⅲ活性)作用下被裂解成21~25nt的双链siRNA,也可在RdRP(以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶,RNA-directed RNA polymerase)作用下自身扩增后,再被Dicer酶裂解成siRNA和miRNA。

 

siRNA的双链解开形成的单链与RISC(RNA诱导的沉默复合体)结合,再参与同siRNA互补的mRNA结合而使mRNA裂解。

 

同时,siRNA可作为特殊的引物,以mRNA为模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用,通过这个聚合酶链式反应,细胞内的siRNA大大增加,显著增加了对基因表达的抑制。

 

从21~23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi,但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

 

miRNA约为21nt的单链结构,其对基因的沉默原理与siRNA类似。单链的miRNA与PPD家族的蛋白质结合,形成一种复合体miRNP,从而形成了成熟的miRNA。大多数miRNA与底物mRNA不完全配对结合,它们并不改变miRNA的稳定性,而是通过抑制翻译来使基因沉默。

 

应用

用RNAi来制备药物。根据病原体如病毒、细菌等的致病基因序列,以及生物体内与疾病发生相关的基因序列,设计和制备与这些基因序列有同源序列的双链RNA,转入动植物内使有关的疾病基因“沉默”,达到治疗的效果。

 

以治疗HIV为例,利用siRNA抑制病毒再生或传染所需的蛋白质的生成。它的优势在于能够不损伤细胞而只抑制病毒蛋白质,其专一性是其他药物所难以具备的。研究者们将HIV21编码的rev基因和与它同源的dsRNA共转染到293细胞中,rev基因的表达被显著抑制。CD4基因编码细胞表面HIV病毒的受体,用针对CD4的dsRNA能将细胞表面HIV病毒的受体表达减少75%,从而抵抗HIV病毒的感染。

 

但问题在于目标基因的选择,即如何筛选出针对致病蛋白质而不影响细胞正常的新陈代谢的siRNA。而且艾滋病毒变化迅速,目标RNA序列有可能在短时间内失效。

对其他病毒的治疗也存在类似的问题,如SARS等。目前研究大都处于初期阶段,只在离体细胞或简单的真核细胞上做过试验,况且哺乳动物与人体的RNAi机制尚未清晰。

 

在许多真核生物中都发现了RNAi现象,而在原核生物中却未发现,提示了RNAi的进化地位,但是其在进化中是如何出现的,如何保存下来的,在生物体中的意义有多大,目前均没有分析清楚,还需要更多的研究来阐明。

 

RNAi的出现重新唤起了人们对“RNA”的重视及对“生命起源于RNA分子”这一命题的兴趣。有人认为成千上万非编码蛋白质的RNA分子组成了巨大的分子网络调节着细胞中的生命活动,它们与蛋白质-蛋白质相互作用网络相对应,将为基因组和生命科学研究提供无比美好的前景。

 

RNAi与细胞分化必然有着极其重要的联系,即有可能参与了细胞周期调控机制。

发现RNAi在Epigenetics中发挥重要作用。Epigenetics是指:至少一代的基因表达改变,而基因的编码不变。Epigenetics调控的一种类型是染色体的改变。通过改变染色体的形状(更紧或是更松),来决定哪一个基因表达。RNAi机制在染色体形状的改变中起着非常重要的作用。

 

RNAi已被证实能引导植物干细胞的分化,因而认为RNAi也可能参与指导人的干细胞的分化。由于RNAi在基因表达调控中发挥重要的作用,对RNAi微小的干扰就可能导致肿瘤的发生。干细胞和肿瘤细胞都有共同的特性,例如可塑性和自身更新的特性。这说明它们可能有类似的细胞内分子机器。

 

可将DNA想象成一条高速路,为了正常运行,高速路的一些区段需要照明,也就是说DNA必须被表达;而其它区段则不需要照明,即DNA不需要表达。有一些士兵负责关掉高速路上的某些灯。这些“士兵”就是RNAi。

 

siRNA、miRNA、smRNA……现有的研究已经我们展示了这类不起眼的小RNA的非凡能力。这些RNA身后还有一个更为庞大的家族呢?

 

RNAi技术真正能应用于日常生活为时尚早,还需要进一步广泛深入细致持久的研究。尽管如此,我们依然可以预测,与其它基因技术一样,RNAi技术将在不久的将来会在基因治疗和基因应用中发挥极大的作用,并将给整个生物理论带来巨大而深远的影响。

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