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8.5 基因芯片
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:1659    更新时间:2011/4/15
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微处理器使经济结构发生了根本改变,带来巨大财富,改变了人的生活方式。生物芯片可能从根本上改变医学行为和人的生活质量。

通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。

 

8.5.1基因芯片的原理

生物芯片技术是通过缩微技术,根据分子间特异性地相互作用的原理,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。

生物芯片分为三大类:基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室。

核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。

原理:将一系列的核酸片段固定在芯片载体上作为固相靶片段,待测的核酸片段人工标记上不同的荧光、或同位素等作为探针,一定条件下两者杂交,根据杂交后不同的信号即可获得靶片段的信息,进行计算机分析。

 

基因芯片(Gene chip)或DNA芯片(DNA chip)是最成功的生物芯片。比较成熟的产品有检测基因突变的芯片,检测细胞基因表达水平的表达基因芯片。

生物芯片技术的特点:高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等。

 

基因芯片可用于寻找新基因、DNA测序、疾病诊断、药物筛选、毒理基因组学、农作物优育和优选、环境检测和防治、食品卫生监督、司法鉴定等。

 

8.5.2 基因芯片制备

基因芯片技术主要包括:芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。

生物芯片是以一块有多聚赖氨酸包被的硅片上或玻璃片为载体,采用原位合成和微矩阵(直接点样)的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。

 

原位合成适用于寡核苷酸;直接点样多用于大片段DNA,也用寡核苷酸甚至mRNA。

原位合成有光蚀刻法和喷印法。光蚀刻法可合成30nt左右,喷印法可以合成40~50nt。

点样法较简单,只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。

 

原位光蚀刻合成原理:在合成碱基单体的5‘羟基末端连上一个光敏保护基。第一步利用光照射使羟基端脱保护,然后一个5’端保护的核苷酸单体连接上去,此过程反复进行直至合成完毕。

 

光导原位合成法:在经处理的载玻片表面铺上一层连接分子,其羟基上加有光敏保护基团,可用光照除去,用光刻掩膜保护不需合成的部位,暴露合成部位,光作用下去除羟基上的保护基团,利用化学反应加上第一个核苷酸,所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定,所引入的核苷酸带有光敏保护基团,以便下一步合成。

 

同样方法在其它位点加上另3种核苷酸完成第一位核苷酸的合成。

此法制作的芯片密度可高达106探针/cm2,即探针间隔为5~10μm。

 

原位喷印合成:芯片原位喷印合成原理类似于喷墨打印,不过芯片喷印头和墨盒有多个,墨盒中装的是四种碱基等液体。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。化学原理与传统的DNA固相合成一致。

 

点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过计算机控制的微阵列点样机点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。点样量约为5nl。

 

 

8.5.3 基因芯片样品制备

以一张表达谱芯片需要3μg mRNA计算,需要不同的组织约为0.2~1.5g。

样本采集过程:

①新鲜组织切成多个1cm3块,在RNase-Free 0.9%生理盐水中漂洗。

②用铝箔包裹组织。在铝箔外写明样品编号,投入液氮中。

③分离核酸。

 

8.5.4 杂交

待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及用荧光标记,以提高检测的灵敏度。

杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中,减少生物分子之间的错配率。

 

8.5.5 信号检测和结果分析

杂交反应后芯片上各反应点的荧光位置、荧光强弱可用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得。

样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素,但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多,因此,通过对信号强度的分析,就可以区分正确与错误的配对。

 

根据扫描结果,通过计算机软件处理即可给出目的基因的结构或表达信息。

 

基因芯片技术的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个过程集成化以获得微型全分析系统(micro total analytical system)或称缩微芯片实验室(laboratory on a chip)。

缩微芯片实验室可在一个封闭的系统内短时间完成从样品到获取分析结果的全套操作。

 

8.5.6 基因芯片的应用

①基因表达分析

基因芯片具有高度的敏感性和特异性,可监测细胞中mRNA拷贝的转录情况。分析基因表达时空特征、基因差异表达检测、发现新基因以及大规模DNA测序。

 

基因芯片杂交测序(sequencing by hybridization, SBH):任何线状的单链DNA或RNA均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸(亚序列,subsequence)。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8nt亚序列:

(1)                   CTCATATG

(2)                GCTCATAT

(3)             AGCTCATA

(4)          TAGCTCAT

(5)       TTAGCTCA

 

这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交,那么48个8nt亚序列探针中,仅有上述5个能同靶DNA杂交。

将8nt所有可能的序列组合固定于片基上,对于每一序列其在片基上的位置是预先决定好的。

 

样品扩增并经标记后与片基上所有序列进行杂交反应,就会出现特定的杂交图谱,有杂交信号部位的寡核苷酸片段与待测样品序列是互补的。(首先用生物素标记经扩增的靶序列或样品,然后再与芯片上的大量探针进行杂交。用链霉亲和素偶联的荧光素。具有错配的杂交信号要比正常配对的杂交信号弱许多,借此可将二者区分开)。

 

最后分析产生杂交信号的寡核苷酸序列的重叠情况进而由计算机推导出样品的核酸序列。

 

②基因型、基因突变和多态性分析 

在同物种不同种群和个体之间,有多种不同的基因型,这种不同往往与个体的不同性状和多种遗传性疾病有着密切的关系。通过对大量具有不同性状的个体的基因型进行比较,就可以得出基因与性状的关系。

但由于大多数性状和遗传性疾病是由多个基因同时决定的,利用基因芯片技术可以同时反应数千甚至更多个基因的特性,就可分析基因组中不同基因与性状或疾病的关系。

 

③疾病的诊断与治疗

人类的疾病与遗传基因密切相关,基因芯片可以对遗传信息进行快速准确的分析。

基因芯片技术已被应用于遗传病相关基因的定位、肿瘤诊断、感染性疾病的诊断、耐药菌株和药敏检测等方面的研究。

 

④药物研究中的应用

寻找新药目标之一是应用芯片可以在基因水平上寻找药物靶标。从而找到“导向药物”。基因芯片也被用于寻找蛋白激酶抑制物、细菌或肿瘤组织的耐药性研究、药物处理细胞后基因的表达情况、药物毒性评价等方面。

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