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10.2 转录水平的调控
作者:生科院    文章来源:西北农林科技大学    点击数:5029    更新时间:2011/4/15
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10.2.1 操纵子(operon)学说

10.2.1.1 操纵子学说的提出

细菌能随环境的变化,迅速改变某些基因表达的状态。

E. coli可利用葡萄糖、乳糖和麦芽糖等作为碳源。通常细菌优先使用葡萄糖,当葡萄糖耗尽,经过短时间的适应,细菌就能利用乳糖呈指数式繁殖增长。

 

大肠杆菌二阶段生长现象

 

在无乳糖或其它β-半乳糖苷时,E. coli合成β-半乳糖苷酶量极少,加入乳糖2~3min后,细菌大量合成β-半乳糖苷酶,其量可提高千倍以上。

大肠杆菌利用乳糖时需乳糖透过酶(lactose permease)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)参与。

 

在以乳糖作为唯一碳源时,菌体内的β-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。

 

Jacob和Monod等人对E. coli利用乳糖的适应现象进行研究,1961年提出乳糖操纵子(lac operon)学说。

 

z、y和a是E. coli编码利用乳糖所需酶类的基因,p是转录z、y、a所需要的启动子,调控基因i编码合成的调控蛋白R可与o结合而阻碍从p开始的转录,o就是调节基因开放的操纵基因。

 

乳糖能改变R的结构使其不能与o结合,因而乳糖浓度增高时基因就开放,转录合成所编码的酶类基因,这样E. coli就能适应外界乳糖供应的变化而改变利用乳糖的状况。

 

10.2.1.1 操纵子的组成元件

操纵子是调控原核生物基因表达的功能单位,操纵子的基本组成元件(elements)包括:结构基因、启动子、终止子序列等。

原核生物的多数基因以操纵子的形式组成基因表达调控的单元,共同开启或关闭,转录出多顺反子(polycistron)的mRNA。

 

①结构基因群

一个操纵子中一般含有2个以上的结构基因(structural gene, SG),每个结构基因是一个连续的开放读框(open reading frame),5’-端有翻译起始码,3’-端有翻译终止码。各结构基因头尾衔接、串连排列,组成结构基因群。

 

在第一个结构基因5’侧具有核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS),当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA,就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。

 

②启动子

启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。

操纵子至少有一个启动子,控制整个结构基因群的转录。

 

启动子一般可分为识别(recognition)、结合(binding)和起始(initiation)三个区段。

不同启动子因序列差异而与RNA聚合酶的亲和力不同,启动转录的频率有高有低,即起动基因转录的强弱不同。

 

 

③操纵基因

操纵基因(operator, O)是一段能被调控蛋白特异性结合的DNA序列。

操纵基因常与启动子邻近或重叠,当调控蛋白结合在操纵基因上,会影响其下游基因转录的强弱。

 

乳糖操纵子中的操纵基因(o)序列位于启动子(p)与被调控的基因之间,部分序列与启动子序列重叠。

操纵基因序列具有回文(palindrome)结构。许多操纵子都具有类似的对称性序列,可能与特定蛋白质的结合相关。

 

阻遏蛋白与操纵基因结合,可妨碍RNA聚合酶与启动子的结合及其后基因的转录起始,从而阻遏了这群基因的表达。

能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列,不论其对基因转录的作用是减弱、增强、阻止或开放,都称为操纵基因。

 

④终止子

终止子(terminator T)是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。

操纵子中在构基因群最后一个基因的末端存在一个终止子。

 

原核生物终止子的结构

 

终止子按其作用可分为不依赖ρ因子的强终止子和依赖ρ因子的弱终止子。

强终止子能完全停止转录;弱终止子只是部分终止转录,一部分RNA聚合酶能越过这类终止序列继续沿DNA移动并转录。

 

如果结构基因群中间存在弱终止子,则前后转录产物的量会有所不同,这可作为终止子调节基因表达产物比例的一种方式。

有的蛋白因子能减弱或取消终止子的作用,称为抗终止作用(anti termination),这种蛋白因子称为抗终止因子(anti terminator)。

 

调控基因

调控基因(regulatory gene)是编码能与操纵基因结合的调控蛋白的基因。

与操纵基因结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白(repressive protein),其介导的调控方式称为负性调控(negative regulation)。

 

与操纵基因结合后能增强或起动调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白(activating protein),所介导的调控方式称为正性调控(positive regulation)。

 

某些特定的物质能与调控蛋白结合,使调控蛋白的空间构像发生变化,从而改变其对基因转录的影响,这些物质称为效应物(effector)。

能引起诱导发生的分子称为诱导剂(inducer);

能导致阻遏发生的分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂(corepressor)。

 

根据操纵子的作用方式可分为:①调节分解代谢的操纵子,它们都是属于诱导型,并受cAMP-CAP的调节。分解代谢的底物常为小分子诱导物。②调节合成代谢的操纵子,它们都属于阻遏型,不受cAMP-CAP影响。其中一些操纵子等具有弱化子(例如,Trp、His、Phe、Leu、Thr和Ilv的操纵子),最终产物为辅阻遏物。

 

10.2.2 乳糖操纵子(lactose operon)

10.2.2.1 乳糖操纵子的结构

E. coli乳糖操纵子包括:启动子、操纵基因和3个结构基因(Z、Y和A)等。

 

Z编码β-半乳糖苷酶,催化乳糖转变为别乳糖(allolactose),再分解为半乳糖和葡萄糖;

Y编码乳糖透过酶,促使环境中的乳糖进入细菌;

A编码转乙酰基酶,催化半乳糖乙酰化,可能参与不能分解的β-半乳糖的乙酰化而解毒和排出细胞。

 

 

转录时RNA pol与启动子结合,通过操纵子,按Z→Y→A方向进行转录。

每转录出一条mRNA上都有Z、Y和A基因。

 

z基因5’侧有SD序列,当Lac operon开放时,核糖体能结合在mRNA上。同一个核糖体依次翻译基因群所编码的所有蛋白质。

 

10.2.2.2 阻遏蛋白的负性调控

无乳糖时,Lac操纵子处于阻遏状态。lac I基因在其自身的启动子Pi控制下,低水平、组成性表达产生阻遏蛋白,每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白。

 

阻遏蛋白有几个结构域。头部可被胰蛋白酶切下,是由1~59位残基形成的DNA结合结构域,剩下的核心部分具有聚集成四聚体以及和诱导物结合的能力。

 

阻遏蛋白以四聚体形式与操纵基因作用

 

四聚体中二聚体的DNA结合结构域与Lac操纵子的O1区(中心位于+11)紧密结合,结合位点为反向重复序列。

 

 

另一个二聚体的DNA结合结构域与O2(+410bp处)或O3(-83bp处)疏松结合,将DNA拉成环状。

 

阻遏蛋白总是与DNA结合在一起,它与操纵基因的结合可加强RNA pol与启动子的结合但不能启动转录。

 

在诱导物的作用下,阻遏蛋白构象改变而失去与操纵基因(O1)的结合能力。

 

乳糖操纵子即使在阻遏蛋白的阻遏状态下,也有本底水平的基因表达,由于R与O也偶尔解离,使细胞中有极低水平的β-半乳糖苷酶及透过酶生成。

 

有乳糖时,乳糖受β-半乳糖苷酶的催化转变为别乳糖,与R结合使R构象变化,R四聚体解聚而与O解离。

 

 

基因转录开放,β-半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍。乳糖(别乳糖)作为诱导剂,与R结合起去阻遏作用(derepression),诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放。

 

许多调控蛋白都是变构蛋白(allosteric protein),通过与效应物结合改变构象而改变活性,起到调节基因转录表达的作用。

 

一些乳糖类似物不能被β-半乳糖苷酶分解,却也能与R特异性结合而使其构象改变,诱导1ac操纵子的开放。

如异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside, IPTG)是很强的非代谢性诱导剂;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)也是一种人工合成的半乳糖苷,可被β-半乳糖苷酶水解产生兰色化合物,因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示剂。IPTG和X-gal被广泛应用在分子生物学和基因工程工作中。

 

10.2.2.3 CRP的正性调控

大肠杆菌优先利用葡萄糖作为碳源,葡萄糖的存在可防止从培养基中吸收其它碳源。当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时,lac启动子表达受阻,没有β-半乳糖苷酶活性。

 

PEP:单糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate: glycose Phosphotransferase system,PTS)是一种细菌质膜内的蛋白复合物,它同时被磷酸化并将糖类转移到细胞内。

 

复合物中的ⅡAGlc蛋白(crr编码)由于葡萄糖转运而失去磷酸化,它可结合乳糖透过酶而阻止乳糖进入细胞。

 

ⅡAGlc蛋白的磷酸化形式可激活腺苷酸环化酶,当葡萄糖进入细胞时ⅡAGlc蛋白发生脱磷酸化,导致腺苷酸环化酶活性降低。

因此,当环境中无葡萄糖时,细胞内cAMP含量升高。

 

cAMP可与细菌中的受体蛋白CRP (cAMP Receptor Protein,CRP;也称为降解物基因活化蛋白,Catabolite gene activator protein, CAP)特异结合,使CRP构象改变而活化。

 

一般需要CRP的启动子在-35区(或/和-10区)上有弱的共有序列,CRP可克服启动子的缺陷,提高RNA pol的转录起始效率。

 

CRP上有重要的三个位点参与基因转录激活过程:与RNA pol的a亚基的羧基端结合区域(aCTD)、与a亚基的氨基端结合区域(aNTD)以及与s亚基结合区域。

 

CRP以二聚体形式与DNA结合而发挥作用,二聚体可被单个cAMP激活,CRP单体包括一个DNA结合区和一个转录激活区。

 

CRP二聚体约结合22bp的序列

5'-AAATGTGATCTAGATCACATTT-3'

3'-TTTACACTAGATCTAGTGTAAA-5'

 

CRP的结合可使DNA弯曲成90°

 

结合位点的弯曲可通过电泳迁移率检测

 

在不同的操纵子中,CRP的作用可能有三种不同的方式。

在Lac操纵子中,CRP结合在紧邻启动子上的RNA pol结合位点上游,与aCTD发生作用,同时与b和s亚基相互作用。

 

在gal操纵子中,CRP结合区域与RNA pol结合的区域有重叠,它与aCTD、aNTD以及s亚基都有相互作用。

 

CRP在一些操纵子中可能有2个或多个二聚体结合在DNA的不同位点,例如在ara操纵子中,结合在2个不同位点上的CRP发挥作用。

 

被cAMP活化的CRP能与1ac操纵子的启动子上游CRP位点特异结合。有利于形成转录起始复合物,并增强了RNA聚合酶的活性。使lac operon得到表达。

 

有葡萄糖时,cAMP浓度降低,CRP不能被活化,1ac操纵子表达下降。由于P1ac是弱启动子,只因乳糖的存在而发生去阻遏而使1ac操纵子开放表达水平很低;有CRP加强转录活性,细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。

 

1ac操纵子的强诱导既要有乳糖又要无葡萄糖。通过这种机制,细菌优先利用葡萄糖,只要无葡萄糖而有乳糖时,细菌才利用乳糖。

 

乳糖操纵子属于可诱导操纵子(inducible operon),在缺乏诱导物时,这类操纵子只有本底水平的表达,约为诱导时表达水平的0.1%左右,lac操纵子的表达水平在诱导和阻遏之间的差别在103倍。这也与阻遏蛋白的量有关,若阻遏蛋白少于10个/细胞,就不可能建立起严密的阻遏。

 

10.2.3 色氨酸操纵子(trp operon)

色氨酸操纵子(tryptophane operon)代表了一种衰减调控模式。

Trp是构成蛋白质的组分,当有足够的Trp时,操纵子自动关闭。细菌直接利用外界的Trp。

缺乏Trp时,Trp操纵子被打开,5个结构基因表达,产生3个酶催化分支酸合成为Trp。

 

 

10.2.3.1 Trp操纵子的结构及负调控

合成Trp所需要酶类的5个基因E、D、C、B、A头尾相接串连排列组成结构基因群;受其上游的启动子P和操纵子O的调控。

 

调控基因trpR的位置远离P-O-结构基因群,在其自身的启动子作用下,以组成性方式低水平表达调控蛋白R’。

R’并无活性,当提供足够的Trp时,Trp与R’结合使其构象改变而成为活性形式R,R可与O特异性结合,阻遏结构基因的转录,R的阻遏能力仅为lac I产物的1/1000。

 

这是一种负性调控,即操纵子通常是开放转录的,当有效应物(Trp为阻遏剂)作用时,则阻遏关闭转录。

 

10.2.3.2 Trp操纵子的衰减调控

当Trp达到一定浓度,但还没有高到能够活化R使其起阻遏作用的程度时,产生Trp合成酶类的量已经明显降低,而且产生的酶量与Trp浓度呈负相关。这种调控现象与Trp操纵子特殊的结构有关。

 

在Trp操纵子Ptrp-O与trpE间有一段162bp的先导序列(leading sequence, L)。在L内有一段123~150bp的序列,它在转录起始后可调控转录过程的进行。

当发生缺失突变时(缺失了130~160片段),mRNA总是最高水平表达。

 

当有一定的Trp存在时,RNA pol会提前终止转录,产生一个140nt的RNA分子,而不转录trp合成的基因。这种先导序列起到随Trp浓度升高降低转录的作用,这段序列就称为衰减子或弱化子(attenuator)。

 

色氨酸存在时,由于弱化子的作用导致mRNA转录速率下降。

 

弱化的共同特点是某些外部因素控制着弱化子的发夹形成。即形成终止子结构。弱化子为结构基因的转录设了一道关卡。

 

前导序列包括起始密码子AUG和终止密码子UGA,它编码了一个14个AA的前导肽。编码前导肽的第10、11位是相邻的两个Trp密码子。

 

先导序列含有3对反向重复序列(A=1+2;B=2+3;C=3+4)。

 

在被转录生成mRNA时能形成发夹结构。

 

如果B(2+3)形成发夹结构,A和C都不能再形成发夹结构。

 

 

当A(1+2)形成发夹结构时,B就不能形成发夹结构,却有利于C(3+4)生成发夹结构。

 

C后是poly(U),即C实际是一个终止子,如果转录mRNA时它形成发夹结构,就能使RNA聚合酶停止转录而从mRNA上脱离下来。

 

原核生物转录和翻译几乎同时进行,在Trp未达到能起阻遏作用的浓度时,从Ptrp起始转录,RNA聚合酶沿DNA转录合成mRNA,同时核糖体结合在mRNA上开始翻译。

 

Trp浓度低时,生成Trp-tRNAtrp量少,使核糖体停止在mRNA上的Trp密码子UGG处,使A不能生成发夹结构,而2+3形成发夹结构,阻止了3+4生成终止子,RNA pol可沿DNA继续转录,trp操纵子就处于开放状态。

 

Trp浓度增高,trp-tRNAtrp浓度随之升高,核糖体沿mRNA翻译速度加快,占据到2段的机会增加,2+3形成发夹结构的机会减少,3+4形成终止子机会增多,RNA聚合酶终止转录的几率增加,转录减弱。

 

 

Trp的存在对终止转录是有效的,弱化子仅允许约10%的RNA聚合酶通过。缺乏Trp时,弱化子允许所有的聚合酶通过。

 

当所有的氨基酸都不足时,核糖体翻译移动的速度就更慢,甚至不能占据A的序列,结果有利于1+2和3+4发夹结构的形成,于是RNA pol停止转录。

 

在trp操纵子中,阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用,而衰减子起到细调的作用。

细菌其他氨基酸合成系统的操纵子(如His、Thr、Leu、Ile、Phe等操纵子)中也有类似的衰减子存在。

 

10.2.4 半乳糖操纵子(gal operon)

Galactose operon包括3个结构基因(gal E、gal T、gal k)表达产生的异构酶(UDP-galactose-4-epimerase)、半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase)和半乳糖激酶(galactose kinase)参与Gal代谢,形成UDPGal,用于合成细胞壁。

 

当细胞中缺乏葡萄糖时,这些酶可使Gal转变成G-1-P,供细菌生命活动需要。

 

 

10.2.4.1 gal操纵子的结构

gal操纵子属于诱导型操纵子。调节基因galR距离结构基因galE、T、K及操纵区O等很远,而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。Gal是gal操纵子的诱导物。

 

gal操纵子有两个相互重叠的启动子(现在又发现一个启动子P3),可从两个不同的起始点(gal P1、gal P2)开始转录;

 

gal P1的转录起始依赖于CRP,属于CRP激活型,因此只有培养基中无葡萄糖时才能进行转录。

高水平的CRP能抑制gal P2的转录起始,属于CRP抑制型。因此它完全依赖于葡萄糖。

即:当有CRP时,转录从gal P1开始,当无CRP时,转录从gal P2开始。

 

gal操纵子有两个O区,一个在P区上游-67~53,另一个在结构基因galE内部。

 

10.2.4.2 双启动子的实验证据

一类细菌突变株能在无葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类(gal结构基因高效表达,由gal P1起始转录);

另一类突变株中gal基因的表达完全依赖于葡萄糖,培养基中如无葡萄糖存在,这些细菌的gal基因不表达,不合成半乳糖代谢酶类(由gal P2起始转录)。

 

10.2.4.3 gal操纵子双转录起点的作用

半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长,而且与之相关的UDPGal是E. coli细胞壁合成的前体。在无外源Gal时,UDPGal是通过半乳糖差向异构酶(galE基因的产物)的作用由UDP-葡萄糖合成的。

因此细胞必须一直能够合成差向异构酶才能正常生活。

 

葡萄糖存在时

若无Gal,Gal R可结合在gal OE和OI上,并相互作用形成环,从P1、P2的转录都被阻遏(?缺gal时,P3的作用可能得到体现)。

 

 

当galR仅结合在OE时,P1的转录被阻遏,但P2被激活,P2低水平组成性表达gal操纵子。

当gal存在时,Gal R的阻遏解除,但由于葡萄糖的存在,P1不能启动而只有P2低水平启动转录。

 

无葡萄糖存在

若存在gal,gal的阻遏解除,依赖于CRP的P1高水平表达产生利用Gal的酶类,以Gal为能源和碳源。

gal P2在gal P1的上游(部分重叠),gal P2与CAP位点靠近,在空间位置上CRP的结合抑制了P2的转录。

 

10.2.5 阿拉伯糖操纵子(ara operon)

阿拉伯糖(arabinose)是可作为碳源的五碳糖。

参与阿拉伯糖代谢酶的基因分布于3个操纵子中,但由一个调节基因(araC)的产物调控。

 

araC基因位于另一个操纵子中,它编码的araC蛋白是这3个操纵子的调控因子。

 

10.2.5.1 araBAD操纵子的结构

阿拉伯糖操纵子上3个结构基因(araB、araA和araD)编码的3个酶参与阿拉伯糖的降解。

核酮糖激酶(ribulokinase)、L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase)和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(L-ribulose-5phosphate-4-epimerase)。

 

 

10.2.5.2 阿拉伯糖操纵子的调控方式

araBAD和araC操纵子中有CRP位点,它们的起始转录需要cAMP-CRP,因此葡萄糖存在时araBAD和araC操纵子均关闭。

AraC蛋白的存在抑制araC和araBAD的表达,当无葡萄糖而有Ara存在,Ara可与AraC蛋白结合使araBAD转录。

 

araBAD与一个复合启动子区域和一个调节基因araC相邻。

araBAD和araC基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。

 

AraC由292aa残基组成,其N端结构域(1~170aa)可结合阿拉伯糖并参与形成二聚体,C端(178~292aa)为DNA结合结构域。AraC对araBAD的调控包括正、负调控两种方式。

araBAD上有三个AraC结合位点:araO1(-106~-144)、araO2 (-265~-294和位于araBAD启动子的araI位点。araI位点为两个“半位点”(-56~-78和-35~-51)。araO1在araBAD表达调控中的作用较小。

 

当AraC水平较低时,其基因从Pc开始表达。当AraC蛋白浓度高时,由于AraC与AraO1结合,而araO1与AraC基因的启动子重叠,可阻遏araC基因的表达。

 

负调控

当cAMP水平较低且缺乏阿拉伯糖时,AraC二聚体结合在araO2和araI1半位点使DNA成环,阻遏araBAD的表达。

 

正调控

当Ara存在而无葡萄糖时,Ara与AraC蛋白结合使其构象改变而释放araO2,此时AraC结合在araI1和araI2处。同时由于cAMP的积累激活CRP,活化的CRP结合在位于araO1和araI间的CRP位点。

 

araC + Ara和CRP共同作用可激活RNA pol转录araBAD。因此,AraC具有正、负调控的双重作用。

由于Ara + araC结合在araO1处使araC不能表达。

 

当同时有葡萄糖和Ara时,由于cAMP不能激活CRP,araBAD则不表达,同时araC也不表达。

 

 

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