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第一章 显微镜
作者:生科院植…    文章来源:西北农林科技大学    点击数:3827    更新时间:2010/7/13
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    显微镜分为光学显微镜和电子显微镜。光学显微镜包括单式显微镜和复式显微镜,常用的复式显微镜是研究植物细胞结构、组织特征和器官构造的重要工具。因此,每个学生都必须了解和掌握复式显微镜的构造、使用和维护方法以及显微镜的操作技术。

一、显微镜的类型

    (一)光学显微镜

    光学显微镜是用可见光作光源,用玻璃透镜作成像系统的显微镜,可分为单式显微镜和复式显微镜。单式显微镜结构简单,由一个透镜组成,放大倍数在10倍以下,如放大镜。构造稍复杂的单式显微镜为解剖显微镜,也称实体显微镜,是由几个透镜组成,其放大倍数在200倍以下。放大镜和解剖显微镜放大的物像都是与实物方向一致的虚像,即直立的虚像。复式显微镜结构比较复杂,至少由两组以上透镜组成,放大倍数较高,是植物形态解剖实验中最常用的显微镜,其有效放大倍数可达1250倍,最高分辨力为0.2μm。光学显微镜还包括研究用的暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜等。

    (二)电子显微镜

    电子显微镜是用电子束作照明系统,用电磁透镜作成像系统的一类显微镜,主要由电子束照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统和电源系统五部分组成。电子显微镜分辨率较高,能分辨相距20nm左右的物体,放大倍数可达80~120万倍,其分辨力比光学显微镜大1 000倍,是观察和研究植物超微结构的重要精密仪器。

二、复式显微镜的构造

    复式显微镜有单筒目镜和双筒目镜两种类型。这两种显微镜基本构造相同,都由光学系统部分和用以装置光学系统的机械部分组成(图1-1)。

图1-1 双目复式显微镜的构造
1.目镜;2.止紧螺钉;3.目镜转换器;4.物镜; 5.载物台;6.聚光器;7.聚光器调焦螺旋;
8.调焦装置;9.镜座;10.亮度调节开关

     (一)机械部分

    1.镜座:显微镜的底座,支持整个镜体,使显微镜放置平稳。

    2.镜柱:镜座上面直立的短柱,支持镜体上的各部分。

    3.镜臂:弯曲如臂,下连镜柱,上连目镜筒,为取、放显微镜时手握的部位。

    4.镜筒:显微镜上部圆形中空的长筒,其上端放置目镜,下端与物镜转换器相连,并使目镜和物镜的配合保持一定距离,一般是160mm,有的是170mm。镜筒的作用是保护成像的光路和亮度。

    5.物镜转换器:接于镜筒下端的圆盘,可自由转动。盘上有3~4个螺旋圆孔,为安装物镜的部位。当旋转物镜转换器时,物镜即可固定在使用的位置上,保证物镜与目镜的光线合轴。

    6.载物台(镜台):放置玻片标本的平台,中央有一圆孔,以通过光线。在载物台上装有玻片推动器,当玻片用玻片夹固定好后,调节移动旋钮,玻片能向前后左右移动。

    7.调焦装置:为了得到清晰的物像,必须调节物镜与标本之间的距离,使其与物镜的工作距离相等,这种操作叫调焦。调节物镜和标本距离的装置称调焦装置或叫调节器。调焦装置位于镜柱两侧,有两对齿轮,大的一对叫粗调节器,转动时可使载物台上下升降,转动一圈可以升降10mm。小的一对为细调节器,旋转一圈可使载物台升降0.1mm。

    8.聚光器调节螺旋:在镜柱的左侧或右侧,旋转它可使聚光器上、下移动,借以调节光线。

    (二)光学部分

    光学部分由成像系统和照明系统组成。成像系统包括物镜和目镜,照明系统包括反光镜或电光源和聚光器。

    1.物镜:是决定显微镜质量的最重要部件,安装在镜筒下端的物镜转换器上,一般有4个放大倍数不同的物镜,即低倍物镜(4×和10×)、高倍物镜(40×)和油浸物镜(100×),使用显微镜时可根据需要选择。物镜放大倍数一般在物镜镜头上注明,同时还标有数值孔径,物镜可将被检物体作第一次放大。
显微镜的工作距离是指物镜最下面透镜的表面与载玻片(厚度为0.17~0.18mm)上表面之间的距离。物镜的放大倍数愈高,它的工作距离愈小(表1-1)。一般油浸物镜的工作距离仅为0.2mm,所以使用时要倍加注意。

    2.目镜:安装在镜筒上端,也叫接目镜,通常由两个透镜组成,上面的透镜与眼接触叫接目镜,下面一个靠近视野叫会聚透镜或视野透镜。目镜的作用是将物镜所成的像进一步放大。常用的目镜有5×,10×和16×等,目镜的放大倍数一般在目镜镜头上注明。

    3.反光镜(反射镜):反光镜有两面,一面为平面镜,反光较弱,当室内光线较强时,可使用平面镜;另一面为凹面镜,能会聚光线,光线较弱时使用。反光镜具有能转动的关节,可作各种方向的翻转,面向光源,能将光线反射在聚光器上。有的显微镜在底座上安装反射镜的位置安装电光源,电光源是6伏10瓦的卤钨灯。

    4.聚光器(或聚光镜):聚光器装在载物台下,由聚光镜(几个凸透镜)和虹彩光圈(可变光栏)等组成,它可将平行光线汇集成束,集中在一点,以增强被检物体的照明。聚光器可以上下调节,如用高倍镜时,视野范围小,则需上升聚光器,用低倍镜时,视野范围大,可下降聚光器。

    5.虹彩光圈:装在聚光器内,位于载物台下方,拨动操作杆,可使光圈扩大或缩小,借以调节通光量。

三、使用显微镜的主要步骤和方法

    (一)取镜和放置

    按固定编号从镜盒中取出显微镜。取镜时应右手握住镜臂,左手平托镜座,保持镜体直立,防止目镜从镜筒中滑出。放置显微镜时,动作要轻,一般应放在座位的左侧,距桌边约5~6cm处,以便观察和防止显微镜掉落。

    (二)对光

    使用自然光或日光灯照明时需要调节反光镜,对光时,先把低倍物镜转到中央,对准载物台上的通光孔,然后用左眼或双眼从目镜向下注视,同时用手转动反光镜,使镜面向着光源。一般用平面镜即可,光弱时可用凹面镜。当光线从反光镜表面向上反射入镜筒时,在镜筒内就可以看到一个圆形的明亮视野。使用电光源时应接通电源,打开开关,调整电位器手柄,使光亮合适并充满整个视场,此时再利用聚光镜或虹彩光圈调节光的强度,使视野内的光线既均匀明亮又不刺眼。

    (三)双目镜筒间距的调节

    用双筒目镜观察时,有时会看到重像,有时只能用一个目镜观察,这是由于双筒目镜镜间距与观察者的瞳孔距不一致造成的。调节双目镜筒间距时,用10×物镜观察,双眼注视目镜,同时水平方向向外拉动目镜筒,使两目镜的中心距离与观察者的瞳孔距离一致,此时两个圆形视野合二为一。

    (四)低倍物镜的使用

    观察任何标本,都必须先用低倍镜,因为低倍镜视野范围大,容易发现目标和确定要观察的部位。使用低倍镜的操作步骤如下:

    将玻片标本放于载物台上,并用弹簧夹固定(将玻片夹在弹簧夹之间),旋转玻片推动器前后和左右移动旋钮,使玻片标本正对通光孔的中心。再将低倍物镜(10×)旋转到中央,小心向上旋转粗调节器,使物镜离玻片约1cm左右,然后通过目镜一边观察标本,一边旋转粗调节器,使载物台慢慢向上移动,直至看到物像为止,这时,进一步用细调节器上下转动,使物像达到最清晰的程度。焦点调好后,可根据需要移动玻片,把要观察的部分移到视野正中心,找到物像后,还可根据材料的厚薄、颜色、成像的反差强弱是否合适等再进行调节。如果视野太亮,可降低聚光器或缩小虹彩光圈或降低电压,反之则升高聚光器或开大光圈或升高电压。

    (五)高倍物镜的使用

    观察较小物体或细微结构时可使用高倍物镜(40×)。由于高倍物镜只能把低倍镜视野中心的一小部分加以放大,因此,使用高倍镜前,应先在低倍镜下选好目标,将其移至视野中央,转动物镜转换器,把低倍物镜移开,小心换上高倍物镜。正常情况下,当换上高倍物镜后,在视野中即可见到模糊的物像,只要略微调动细调焦螺旋,就可获得清晰的物像。换用高倍镜观察时,视野变小变暗,所以要重新调节视野亮度,此时可升高聚光器或放大虹彩光圈或升高电压。

    (六)油镜的使用

    油浸物镜使用前,必须先从低倍镜下找到被检部分,再换高倍物镜调整焦点,并将被检部分移到视野中心,然后再换用油浸镜头。使用油镜头前,一定要在盖玻片上滴加一滴香柏油(镜油),然后才能使用。当聚光器镜口率在1.0以上时,还要在聚光器上面滴加一滴香柏油(油滴位于载玻片与聚光器之间),以便使油镜发挥应有的作用。
用油镜观察标本时,绝对不许使用粗调焦螺旋,只能用细调焦螺旋调节焦点。如盖玻片过厚,则不能聚焦,应注意调换,否则就会压碎玻片或损伤镜头。

    油镜使用完毕,需立即擦净。擦拭方法是用棉棒或擦镜纸蘸少许清洁剂(乙醚和无水酒精的混合液,最好不用二甲苯,以免二甲苯浸入镜头后,使树胶溶化,透镜松解),将镜头上残留的油迹擦去。否则香柏油干燥后,就不易擦净,且易损坏镜头。

    (七)显微镜使用后的整理

    观察结束后,调节电压调节杆到最小值,然后关掉电源开关。旋转粗调焦螺旋,使载物台下降到最低位置,取下玻片,擦干净镜体,罩上防尘罩,然后用右手握住镜臂,左手平托显微镜底座,按号收回镜箱中。

四、放大率、镜口率和视野宽度

    显微镜的总放大率是由目镜和物镜原有放大倍数的乘积来表示的,如果目镜放大率为10×,物镜放大率为40×,那么显微镜的总放大率=10×40=400倍。如果目镜的放大倍数过大,得到的放大虚像则很不清晰,所以一般目镜不宜过大。

    被检物体细微结构的分辨力并不完全取决于放大倍数,而主要是由镜口率决定的。在物镜镜头上常标有N.A 10/0.25,N.A 40/0.65,N.A 100/1.25(油镜头)。 N.A表示镜口率,也就是数值孔径。N.A的值越大,分辨能力越高。所谓分辨力是指分辨被检物体细微结构的能力,即判别标本两点之间最短距离的本领。因此,镜口率越大,物镜的价值越大,它是衡量显微镜质量的最主要依据。欲使显微镜发挥它的能力,除有高级物镜外,还必须有优良的聚光器,因为物镜分辨力受聚光器镜口率影响。物镜有效镜口率的计算公式如下:

    例如:镜口率为0.65的物镜,如与镜口率为0.45的聚光器配合使用,则物镜的有效镜口率就降低为0.55。因此,聚光器的镜口率应该与物镜的镜口率一致。通常聚光器上仅刻有最大镜口率的数值,因此,在使用时要注意调节,使二者镜口率相等。

    目镜光栏所围绕的圆即视野宽度。视野宽度愈大,观察玻片标本的面积愈大,则显微镜放大的倍数愈小。所以,视野宽度与放大率成反比。因此当你将低倍物镜转换成高倍物镜时,必须先把标本移到视野正中央,否则标本的影像落到缩小的视野外面,反而找不到需要进一步放大的物像。

五、显微镜测微尺的使用

    显微镜测微尺能正确量出显微镜内所观察物体的大小,通常包括镜台测微尺和接目测微尺两部分,两者配合使用测量被观察物体的长度和面积。

    1.镜台测微尺:是一块长方形的载玻片,在中央部分有一具等分线的圆形盖玻片,上面的等分线长为1mm,被分成100个小格,每小格长0.01mm,即10μm(图1-2)。

图1-2 镜台测微尺
A.标尺的放大; B.具标尺的载玻片

    2.目镜测微尺:是放在目镜内的一种标尺,是一块圆形玻璃片,直径20~21mm,正好能放入目镜内,上面刻有不同形式的标尺。有直线式和网格式两种,用于测量长度的一般为直线式,共长10mm,也被分成100个小格,网格式的测微尺可以用来计算数目和测量面积(图1-3)。

图1-3 目镜测微尺
A.直线式; B.网格式

    3.长度测量法:测量长度时,通常以目镜测微尺和镜台测微尺配合使用,先将目镜测微尺的圆玻片放入目镜中部的铁圈上,观察时即可见标尺上的刻度,但其每一个小格的长度不是固定的,而是随着物镜放大倍数的变化而变化,所以不能直接用它来测量长度,必须先用镜台测微尺确定它每一小格的值。具体方法是:先将镜台测微尺放在载物台上,如观察普通标本一样,调节焦距,使标尺上的刻度观察清楚后,即可移动镜台测微尺,使镜台测微尺与目镜测微尺的刻度重合(图1-4),选取成整数重合的一段,记录两者的格数,然后计算目镜测微尺每格的长度。如果目镜测微尺的100格等于镜台测微尺的50格,那么在当前的放大倍数下目镜测微尺每格的长度为5μm。这时,就可将镜台测微尺移去,换上待测量的标本,如果用目镜测微尺测得细胞长度为10个格,那么细胞的实际长度为5×10=50μm。

图1-4 测定目镜测微尺每格的实际长度
上方的标尺为目镜测微尺,下方为镜台测微尺,目镜测微尺的100格与镜台测微尺的50格重合。

六、解剖显微镜的构造和使用方法

    解剖显微镜的机械部分由底盘、载物台、镜柱、镜臂、调焦手轮和物镜变倍手轮等组成;光学系统由变倍物镜、半五角棱镜、直角棱镜和目镜组成(图1-5)。被观察物体经变倍物镜第一次放大后,成像于视场光栏处,再由目镜作第二次放大,半五角棱镜可使光轴偏转45°(便于观察),直角棱镜则使物像正转,使目镜焦平面上观察到与物体方位一致的正像,这有利于在解剖镜下的实际操作。直角棱镜组可转动,以便调节瞳间距离,满足不同的双眼瞳距,变焦系统为机械补偿式结构,通过物镜变倍手轮旋转,可选择物镜的放大倍率,并能获得稳定的像面。

图1-5解剖显微镜的构造
1. 棱镜照壳; 2.目镜;3.物镜;4.压簧片;5.载物台;6.变倍调节手轮;
7.调焦手轮;8.反射照明器;9.底盘;10.双向开关

    解剖显微镜的操作步骤如下:

    1.接通电源,根据使用者需要可选择透射或反射照明系统。

    2.将被观察物体放在载物台中心位置,并用片夹压稳。

    3.扳动左右目镜筒,使之与使用者双眼瞳距一致,便于观察。把物镜调节到最低倍率(0.7X),然后慢慢转动调焦手轮,先使右目镜能看到清晰物像,再调节左目镜视度圈,使左目镜得到与右目镜同样清晰的物像。

    4.根据使用者的需要,可通过变倍调节手轮调节放大倍率。

七、使用显微镜的注意事项

    显微镜是一种结构很精密的仪器,使用时必须十分小心,并注意下列事项:

    1.使用显微镜时,必须严格按照操作规程进行。

    2.使用显微镜时应轻取轻放,防止震动和暴力,以免造成光学系统光轴的偏斜而影响观察。

    3.使用显微镜时不得自行拆开光学零件,不要把目镜从抽管中取出,否则会使灰尘落人镜筒内,不易清除。如果必须将目镜取出,应立即用布或其它物品把它盖好。

    4.用高倍物镜观察标本时,必须先用低倍物镜观察,调节焦距,观察到清楚的像后,再换高倍物镜,慢慢调节细调节器,直至物像清楚为止。高倍物镜的工作距离较小,操作时要非常小心,以防压碎切片。

    5.油浸物镜一定要在盖玻片上滴油后才能使用,用毕应立即将油擦干净。方法是用擦镜纸蘸二甲苯少许,将镜头上残留的油渍擦净,否则干后就不易擦去,而损伤镜头。

    6.为了保持显微镜各部分的功能,必须尽量避免潮湿和灰尘,否则就会影响镜头和各个活动部分的使用。因此,须经常备一块纱布和一块绸布,用纱布拭去金属部分的水分、潮气或灰尘等;绸布用来拂去光学玻璃部分的灰尘。在气候潮湿地区,应在显微镜的箱内放氯化钙,保持干燥,防止镜头发霉,氯化钙失效后须立即更换。

    7. 化学试剂很容易污染光学玻璃,使它晦暗变色。有些化学试剂的蒸汽也易氧化镜头。所以须将光学玻璃保护好,避免和化学试剂或药品接触与靠近。存放之前,必须擦拭干净。物镜里面不易清洁,可用毛笔拂拭,切不可用手指触及玻璃。镜头外面可用擦镜纸蘸少许乙醚与酒精的混合液擦拭。

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