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第二章 基本实验技术
作者:生科院植…    文章来源:西北农林科技大学    点击数:2122    更新时间:2010/7/13
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    由于大部分植物器官和组织是不透明的,不能直接在显微镜下观察,需要经过一系列的处理,使光线能够透过要观察的材料。因此,有必要学习和了解植物形态解剖学的基本实验技术。植物制片方法很多,读者可根据不同研究目的和观察对象,选择不同的制片方法,并选择合适的染料进行染色,最终获得具有较好观察效果的制片。

一、实验材料的采集和保存

    为了全面观察到组织和细胞中各种细致的结构,采集标本时必须选择健全而有代表性的植物,尽可能不要损伤植物体或所需要的部分。如果所采集的材料应立即杀死固定,而条件不能满足时,应尽量防止材料变干、损伤和生霉。已经压制的干标本可以将它放在水中浸软后再做切片,但只能用以观察维管束排列等较大的构造,不能作精细研究。现将采集各类植物和不同器官时应注意的事项分述如下:

    :采叶时,用刀片将叶柄切下,如果不能立即固定杀死,可将叶片夹在潮湿的纸内,放在采集箱或其它密闭容器内。带回来的叶子如有枯萎现象,须先使之潮湿,恢复原状后固定。

    :带有叶子的茎,采回后如果不能立即固定杀死,可放在盛水的花瓶或其它容器内养几天。野外采集,没有条件用此法保存,可将茎切成很长的几段,用湿纸包起来,放在采集箱内带回实验室后取样固定。

    :采集根及其它地下器官时,不要用力将根拔出,以免柔软的皮层与中柱部分分离,而一定要先把泥土翻开,把根挖出,将泥土洗净,然后用湿纸包好后拿回实验室固定杀死。

    :将整个花或花序摘下来,包在潮湿的纸内,然后贮藏在密闭容器内,放在阴凉处,果实采集与贮藏也可以这样。

    苔藓植物:应将一大簇植物连底土一起采,然后放在潮湿容器内,使植物体吸收水分而展开,把植物体放在解剖镜下,将所需部分解剖出来固定。

    藻类植物:将藻类带水一起采集,放在阴凉处。许多丝状藻类拿回实验室中将会很快衰老而死亡,所以这些藻类采到后须立刻固定。

    肉质菌类:许多大的肉质菌类可以包在蜡纸里贮藏一段时间,但不可太久,否则容易损坏。小的菌类应夹在潮湿的纸内,再包上蜡纸,但时间不可太长,固定愈快愈好。

    病理材料:采集病理标本时,应特别注意不能将寄生的组织损伤,要防止枯萎、发霉和其它细菌的侵害。为和正常无病组织相区别,采集时,除了病理标本外,正常组织的标本也须采集,以便将来作比较观察。

二、植物材料的分割与固定

    (一) 植物材料的分割

    植物材料采到后,尽可能快的杀死与固定,使各细胞立即停止生命活动,以保持原生质的原有形状。常用固定液对植物体外表的角质、木栓质等的穿透很慢,但对于被切割的表面,则穿透较快。所以,固定材料时,应将所要固定的部分分割成小块、小段或小片,以达到立即杀死与固定的目的。

    分割柔软而新鲜的材料可用刀片切开。分割叶片时,如果叶片宽度不超过5mm,则可沿中脉横切,每片长约3~5mm。如果叶片比较宽阔,可分割成许多小片,选择其中含有主脉和侧脉的固定。如果固定蕨类叶片及有病的叶片,则应选择含有孢子囊及菌孢的小片。

    草本植物的根、茎、叶柄或其它圆形的器官分割时,如果直径不超过2mm,而其表面具有厚的角质层,则可切成长约2mm的小段,如果其表面非角质化,则可切成10mm长的小段;如果根或茎的直径为5mm,应切成5mm长的小段;其直径为1cm,应切成2~5mm长的小段。直径较大的茎,可切成5mm长,且可分割一半或四分之一。

    木质小枝的直径为5mm以内时,可用锐利的刀片将其切成15mm长的小段。要作木材的横切面、径切面、切向切面时,常用伐下的完整无损的木条和大枝,其直径在10cm以上的,切成2~3cm厚的小盘状,然后沿射线方向,将它分割为楔形小块,保留有几圈年轮、形成层及其外面各部分,修整后固定。

    (二) 植物材料的固定

    要使植物组织在切取以后仍能保持原来状态,必须将植物组织迅速杀死固定,使它们不至于在死亡前,形态及结构有更多的内部或外面变化。最主要的杀死与固定药剂有乙醇、福尔马林、醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、升汞和锇酸等。

    1.福尔马林[Formalin,37%~40% 的甲醛(HCHO)]

    福尔马林是甲醛的水溶液,市售的约含37%~40% 甲醛。固定和保存时所用溶液为福尔马林的百分比,而不是甲醛。例如10% 福尔马林溶液是10ml的福尔马林加上90ml的水配制而成。所以10% 的福尔马林实际上仅含3.7%~4% 的甲醛。

    福尔马林易被氧化为甲酸(formic acid),故常带酸性,它的pH常在3.1到4.1之间。欲得中性福尔马林,可加吡淀、碳酸钙或碳酸镁使之中和。例如10% 的福尔马林可被过量的碳酸钙中和为pH 6.4;用过量的碳酸镁中和,则pH为7.6。福尔马林若贮藏较久或存放在温度低的地方会变浑浊,甚至形成白色胶冻状沉淀物,成为高度聚合的形式而使它变性。若加入少许甘油则能阻滞它的聚合,或者将沉淀物加热会使其溶解。如加热后仍不溶解,则可用等量的热水(约60℃~70℃),每一升水中溶以8g碳酸钠或4g氢氧化钠,将这种溶液倒入福尔马林中搅拌,然后在温室内放置二至三天,沉淀物就会消失。这时福尔马林溶液淡了一倍,稀释时要相对地减少一半。

    用福尔马林固定材料后,组织硬化程度显著,但收缩很少。通常很少单独使用。

    2.卡诺氏液(Carnoy's Fluid):适用于胚胎学和细胞学研究。

   

    处理:固定时间为12~24h,有的也可缩短,例如根尖可固定15min,花药固定1h,子房固定12~24h。固定完毕可用95% 或纯酒精洗涤,换二次,经二甲苯与纯酒精等量混合液过渡,二甲苯透明两次,就可进入石蜡中浸蜡。

    特点:这两种固定液穿透力强而快,纯酒精固定细胞质,冰醋酸固定染色质,并能防止组织由酒精所引起的高度收缩与硬化。

    3.福尔马林一醋酸一酒精混合液(FAA):适用于除单细胞及丝状藻类以外的植物组织,但不适于作细胞学研究。

    

    处理:(1)一般柔软材料,特别是苔藓植物,可用低度(50%)酒精。(2)固定时间最短需18h,也可无限期延长,木质小枝至少须固定一周。(3)冲洗时材料可直接换入50% 酒精中洗一、二次,木质材料在流水中冲洗48h,并在酒精(50%)和甘油溶液(1∶1)中浸2到3d,使其软化。

    4.纳瓦兴氏液(Navaschin’s Fluid):适于植物组织及细胞学研究

   
    在使用之前,将甲、乙两液等量混合。

    性质:当两液混合后几小时,溶液的颜色逐渐改变,数天后铬酸还原成绿色的氧化铬。出现这种情况之前,杀死与固定的作用已完成,材料可在此液中长期保存。

    处理:固定时间为24~48h,固定后可直接在70% 酒精中洗几次,再继续脱水。

    5.铬酸--醋酸固定液:常用于容易渗透的材料,如丝状藻类、菌类和蕨类原叶体等。

   
    处理:固定12~24h,此液不能作保存液,制片前必须在流水中冲洗12~24h或用下列浓度,配成弱、中二种固定剂:

     

    弱液用于固定较柔嫩的材料,如藻类、真菌类、苔藓等;中液用作固定根尖、子房、胚珠等。固定24h后,在流水中冲洗干净。

    6.桑弗利斯液(Sanfelice Fluid):适用染色体和有丝分裂的纺锤体。

    

    配制:使用之前,将甲、乙两液等量混合。

    处理:固定时间为4~6h,固定完毕,流水冲洗6~12h。

三、植物制片中常用的染色剂及染色程序

    植物组织或细胞,如果不经过染色,在某一限度内,亦可因为各部分折光的不同,能够在显微镜下观察。但做成永久切片,用加拿大树胶封固后,折射率变为均匀,如果未加染色,那么组织及细胞的结构反而不明显,难于观察。所以在制作切片时,为了使组织及细胞各部分显示清楚,常应用染色的方法。采用不同颜色染不同部分,或者使某些部分染色而使背景不染色,这样使组织及细胞结构在光学显微镜下能很好地显示出来。

    1.番红一固绿对染法

    高等植物根、茎、叶组织切片,常用番红一固绿二重染色法,结果是木质化的细胞壁及细胞核染成红色,薄而具纤维素的细胞壁及细胞质染成绿色。染色步骤如下:
石蜡切片在二甲苯中溶去石蜡,依次经过二甲苯、1/2二甲苯+1/2纯酒精、纯酒精、95% 酒精、85% 酒精、70% 酒精,进入番红溶液(1% 的50% 酒精溶液)中染色1d,经过70% 酒精、85%酒精后,进入固绿溶液(0.5% 的95% 酒精溶液)中染色5~30秒,然后依次进入95% 酒精、纯酒精二次、二甲苯二次,最后用加拿大树胶封片。
染色过程中应注意:番红与固绿在酒精溶液中很容易掉色,因此在酒精中脱水时,不能放置太久,各约30秒至1分钟即可。其次是用固绿对染之前必需检查番红染色是否合适,应该使颜色过深一些。

    2.爱氏(Ehrlich)苏木精整体染色法

    所谓整体染色法是指材料经过固定之后,于脱水之前先行染色,然后再按常规方法脱水、透明、浸蜡、包埋与切片,切片经脱蜡后即可封片观察。

    爱氏苏木精原液配方

                                      


    配制方法如下
    (1) 取1000ml容量的广口瓶一个,倒入少量95% 乙醇,再加入苏木精,然后加入冰醋酸,搅拌使苏木精溶解。(2) 加入甘油和其余的95% 乙醇。(3) 在研钵中将钾矾研碎,倒入盛有蒸馏水的烧怀中,加温使钾矾完全溶解。(4) 将温热的钾矾溶液一滴一滴加入盛有苏木精染液的广口瓶中,并不断搅动。(5) 用双层纱布蒙住瓶口,再用橡皮筋绑扎,使纱布固定。(6) 将染液瓶置暗处,经常摇动促进成熟,直到颜色由浅褐变成深红为止。
此染液最好在7~8月间配制,约3~4周即可使用。如急用,可加入1g碘酸钠促其成熟。

    稀释液配方

                     

    按上述比例将三种试剂混合后即可整体染色。

    制片程序如下

    (1) 选取根尖、茎尖、花药、子房或胚珠、花芽等作为材料。

    (2) 材料经纳瓦兴固定液(或按需要选用固定液)固定24h后经水浸洗,或在30% 乙醇中洗涤数次,换入50% 乙醇1~2h(如需保存材料可继续脱水至70% 乙醇中,贮存于冰箱中)。倒去乙醇,加入上述经稀释的苏木精染液,染色2~3d。倒去染液,加入蒸馏水浸洗,换洗数次至水中无浮色。换入自来水使材料返蓝,换自来水数次,最后经过蒸馏水换入30%乙醇,然后按常规石蜡切片法脱水制片。染色结果:核仁、染色质被染成蓝紫色。

    3.结晶紫--碘染色法

    适用于植物分生组织和小孢子母细胞的制片,染色结果:染色质和核仁被染成深紫色,细胞质无色。石腊切片在二甲苯中脱蜡后经1/2二甲苯+1/2纯酒精、纯酒精、各级浓度酒精下降至蒸馏水中,进入1% 结晶紫水溶液染色3~10min,用水洗去浮色,在碘、碘化钾溶液中媒染15~60秒(1% 碘与1% 碘化钾溶于70% 酒精中),经70% 酒精、80% 酒精、95% 酒精、纯酒精两次、各级脱水5~10min,在丁香油中分色至颜色适中,经两次二甲苯透明(每次30min至1h),用加拿大树胶封片。

    4.海登汉氏(Heidenhain’s)铁矾苏木精染色法

    适用于一般组织学和细胞学的结构,如细胞核及染色体等。染色结果:染色体、淀粉核和中心体被染成蓝黑色至紫色或黑色,木质化、木栓化和角质化的结构染色很淡或不染色,孢原细胞和早期造孢组织被染成灰色。

     

    配制方法
    (1)甲液必须在用时配制,保持新鲜。铁铵矾应为紫色结晶,若为黄色则不能使用。
    (2)乙液在使用前六周配制,将0.5g苏木精溶解于5ml 95% 或无水酒精中让它充分氧化,用时再加100ml蒸馏水。此液配好后可保存3~6个月,但不能与甲液混合,否则会变坏。

    染色程序
    切片脱蜡下降至蒸馏水,在2% 或4% 铁矾中媒染30min至2h,在清水中洗5min,用蒸馏水漂洗,在0.5% 苏木精中染色1~24h,用清水冲洗5min,用2% 或4% 铁矾分色30~60min(镜检至颜色适中),经35% 酒精、50% 酒精,70% 酒精、80% 酒精、95% 酒精、纯酒精两次脱水,每级脱水5min,二甲苯透明两次、每次1h,最后用加拿大树胶封片。

四、植物的一般制片方法

    (一) 徒手切片法

    徒手切片法,狭义上是指用刀把新鲜材料切成薄片的方法。广义来讲,只要不经任何处理而直接用刀或徒手切片器切新鲜材料,通称徒手切片法。徒手切片是制作切片中的一种最简单的方法,对草本植物器官,甚至木本植物较细的嫩枝均可用此法。徒手切片的方法与步骤如下:

    1.取材和切片

    切取一小段(长约2cm)植物的茎(或其它器官),用左手拇指、食指和中指夹住材料,材料要稍高于拇指2mm左右,右手执双面刀片,刀片要锋利,刀口向内自左向右拉刀。切时用臂力而不用腕力,用力不要太猛,不要直切。切片时只动右手,左手不动,更不要来回拉切。不论切什么材料,切片前刀片及材料都要蘸水。每切几片后,用毛笔蘸水将材料转移到有水的培养皿中,然后选择最薄的进行染色装片。有些材料过于柔软,则需要夹入较硬又易切的夹持物中,一般常用萝卜、胡萝卜或土豆等作为夹持物。

    2.固定和染色

    将已经检查合格的切片,移入培养皿中,用滴管分别吸取50%、70% 的酒精溶液放入培养皿,每级固定脱水2~3min(或更长时间),换入1% 番红的70% 酒精溶液,染色5~10min(或更长时间),用70% 酒精溶液洗涤两次,经85%、95% 酒精溶液脱水,每级2~3min,用0.5% 固绿的95% 酒精溶液染色约1/2~1min,用95% 酒精洗涤两次,使颜色深浅适度,最后进入100% 酒精1~2min,两次。

    3.透明和封片

    脱水至100% 酒精时须换干燥培养皿,以保证脱水完全。换入二甲苯透明约2~3min,再将材料轻轻挑起放入清洁干燥的载玻片上,加滴加拿大树胶,盖上盖玻片,烘干。

    (二) 涂抹制片法

    涂抹制片是将植物器官或组织经处理后(例如先染色),把它涂抹或压成一薄层,或不经过任何处理压成一薄层的方法。这可以作为临时观察研究的方法,也可以经过一系列脱水、透明程序后制成永久封片。本法对根尖、茎尖、叶原基、花药等材料很适用,尤其是细胞学研究的重要方法(如染色体计数、核型分析等)。其缺点是制片后组织杂乱,过多地改变了原来的形态结构。涂抹制片法的方法与步骤如下:

    涂抹制片法(如根尖为材料),其一般步骤为:前处理→固定→分离→软化→染色→封片。

    1.前处理:根尖固定、染色之前,用秋水仙素处理,因为秋水仙素能够专一抑制纺锤丝的形成,分裂中的细胞可以被阻止在中期,并使细胞膨胀,染色体缩短分开,以便观察计数。秋水仙素常用0.01%~0.1% 浓度处理1~4h。前处理也可用8一羟基喹啉代替,其浓度为0.004%~0.005%,处理3~4h。当用秋水仙素进行前处理时,假如时间控制不好,染色体会过分缩短,且会出现染色体数目的加倍,必须注意时间不能太长。

    2.固定:经过前处理的材料,一般再经过约1h的短时间固定,尽快杀死细胞,尽可能保持原有结构。通常用的固定液为95% 酒精和冰醋酸(3∶1)配制而成。如不立即涂片观察,材料固定1h后,移入70% 酒精,置于冰箱低温下保存,但一般保存时间不要过长,否则不易涂片和着色。

    3.分离软化:经过固定的材料还需软化,通常用10% 盐酸或者95% 酒精和浓盐酸等量混合配制成的溶液,浸泡20~30min。目的是破坏细胞间的果胶层,使细胞分离软化,便于涂片。

    4.染色与涂片:将软化过的材料,用清水洗涤后,放在载玻片上,用刀片切下根尖染色深的很小一点,其余部分去掉,加上地衣红染色剂,染色数分钟后(时间随不同材料而异),盖上洁净盖玻片,用手指轻压一下,再用铅笔的平头一端,从中心往边缘轻轻敲打,用力不能过猛,在此期间,不要移动盖玻片,涂压成均匀的涂片,便可镜检。

    5.永久片的制作:经镜检,发现理想的片子,可制成永久片,以便较长时间保存,作为观察研究用。制作过程:准备5套直径约12cm的培养皿,每套培养皿中放一根短玻棒,按顺序倒入50% 酒精→95% 酒精→100% 酒精→1/2纯酒精+1/2叔丁醇→叔丁醇。将盖玻片向下放入50% 酒精的培养皿中,一端搁在玻棒上,使盖玻片自然脱落,然后将盖玻片或载玻片(看材料粘在哪个玻片上)顺序脱水各5~10min,最后用滤纸吸去多余的叔丁醇,滴上加拿大树胶封片。

    (三)组织分离制片法

    植物组织分离制片法,是用各种机械或化学药剂等处理,使组织中的细胞彼此分离的制片方法。分离出来的细胞单元,可以在显微镜下观察其长、宽、厚的立体形态结构。

    1.硬组织离析法

    (1)杰弗赖(Jeffrey)离析法(即硝酸一铬酸法):取枝条等硬组织,用利刀纵削成长约1~2cm的碎片,投入试管中,加水煮沸数分钟,排出材料中的空气,直至材料沉入试管底部。然后浸泡入杰弗赖浸离液(此液是10% 硝酸与10% 铬酸等量混合的浸离液)中,放在35℃温箱中2~3d。在浸离过程中,浸离液由红黄色渐变为绿色,以至黑绿色,浸离液的作用也渐渐减弱。如果材料仍未松软,可重新换新的浸离液,加速细胞离析。离析完毕,倾去浸离液,用水冲洗4~5次,每次5~10min,将酸类完全冲洗掉,保存于70% 酒精中备用。洗涤时,由于材料松软,细胞全离析不易收集,最好用离心机离心。

    (2)舒尔泽(Schultze)法(即浓硝酸法):浓硝酸离析作用很强,适用于极坚硬的材料(如木材的离析)。具体方法:将坚硬的木材块,先敲成碎块,然后投入盛有浓硝酸(用市售浓硝酸加1份蒸馏水制成)的试管中,材料需完全浸没在硝酸溶液中,再加入少量氯化钾晶体,在酒精灯上微微加热以至沸腾,直至材料变白为止,倾去浸离液,用清水冲洗4~5次,并随时用玻璃棒搅动,最后保存于70% 酒精中。

    2.软组织离析法

    (1)盐酸法:将植物茎段沿纵轴切成若干小片,浸入4份95% 酒精及l份盐酸的混合液中1~2d;经水洗,换4~5次,移入10% 氨水10~15min,再用水洗;为了加速离析,可用玻棒搅动,用解剖针撕分;分离后的材料保存于70% 酒精中备用。

    (2)氨水离析法:适用于观察分生组织细胞的立体形态结构。将刚发芽的蚕豆、大豆或其他植物幼根,纵切成薄片,在浓氨水中浸泡24h,以溶去细胞之间的中胶层,再在10% 氢氧化钠的50% 酒精溶液中浸24h,然后用水清洗。最后,用染纤维素的方法染色,使材料出现深蓝色。取少许材料于载玻片上,盖上盖玻片,用解剖针柄轻敲,使细胞完全分离。在显微镜下可以观察到分生细胞的立体形态。

    染色方法:用1% 碘液滴在材料上,然后再加一滴66.5% 硫酸染色,使材料变深蓝色。

    1% 碘液的配制:先将1.5g碘化钾溶于100ml的蒸馏水,待全溶解后,加入1g碘,震荡溶解。
    66.5% 硫酸溶液的配制:7份浓硫酸加上3份蒸馏水配制而成。配制时将浓硫酸慢慢加入蒸馏水中,并不断用玻棒搅动。

    (四)临时装片法

    临时装片法是将实验材料(已切好的徒手切片或一些低等植物如衣藻、水绵等小型实验材料)放置在载玻片上,加一滴水,然后加盖盖玻片,做成临时装片进行显微镜观察。具体操作方法如下:

    先用滴管在洁净载玻片中央滴-滴清水,然后把准备好的材料放在载玻片上的水滴中,用拨针或镊子将材料展开,使各部分都在同一平面上。用镊子夹起盖玻片,使盖玻片的一边接触水滴边缘,然后轻轻放下盖玻片。这样,盖玻片下的空气被水挤掉,可以避免产生气泡。

    如果所做的临时切片需要染色,可在盖玻片一边加一滴染色剂,在盖玻片另一端用吸水纸吸水,让染色剂迅速扩散,进到材料中进行染色。也可以在加盖盖玻片前加染色剂。

    (五)石蜡切片法

    一般可以经得住石蜡法中各种药剂处理的材料都可以用石蜡法制片。用石蜡切片法能切成极薄而连续的切片,因此是植物制片中最常用的一种方法。

    石蜡切片法的操作步骤比较复杂,具体过程如下:

    1.选择材料:用作制片的材料,应根据观察目的适当选择。

    2.材料固定:将选择好的材料,用水洗去上面尘土。用根作制片,则应先放在水中用毛笔轻轻洗刷干净,然后用刀片截取材料。柔软材料的截取,可放在一张湿滤纸上或放在指头上小心切下,切时压力不能太大,以免压坏组织。为了使固定液迅速透入材料,截取的材料体积不宜过大,一般以不超过0.5~1cm3为宜。体积大者,宜切短些,体积小者,可切长些。圆柱状的材料,其直径超过1cm者,则应劈成半圆或1/4。

    材料切好后,应立即投入固定液中。固定液的选择,按材料性质及制片目的而定。固定液的用量,一般最少为所固定材料总体积的20倍。含水分少的材料可减少固定液的用量,含水分多的材料应多换一次固定液,以保证固定液维持一定浓度。

    通常材料多含有空气,以致固定时漂浮起来,而且阻碍固定液透入,所以材料放入固定液后要抽气。最常用的抽气方法是用吸滤原理把盛有材料及固定液的小玻璃瓶放在过滤瓶中进行抽气。抽气时不宜太快,否则易使组织受到损伤,或把材料抽出固定液之外,抽过气的材料,应沉入固定液中。

    材料固定完毕,若不忙于制片,如果所用固定剂又可作保存剂,可以放在固定液中保存起来;如果是不能作保存的固定剂,必须换至70% 酒精中保存。

    3.脱水:用作脱水的药品,一方面是喜水性的,能与水混合用以除去细胞中的水分;另一方面必须能与其他有机溶剂互相替代。最常用的脱水剂为乙醇,一般经过下列各级浓度:50%、70%、85%、95%、100%。材料在各级酒精中的时间,视材料大小而定,如果材料不太大时(小于2 mm3)每级2~4h,已切好的切片每级停留3~20min。

    4.透明:脱水后要经过一种药剂,一方面使材料透明干净,另一方面便于包埋剂及封固剂的进入。一般应用酒精脱水的制片,都要经过透明步骤,材料经1/2纯酒精和1/2二甲苯混合液后,进入纯二甲苯中透明,每级停留2~6h。在1/2纯酒精和1/2二甲苯混合液中时,可加入少许番红干粉,使材料着色,便于包埋在石蜡中后容易看见材料,切片时易于辨别材料的方向。

    若材料放入1/2纯酒精和1/2二甲苯混合液中时,溶液变混浊,说明材料中含有水分,材料脱水不彻底,应把材料逐步退回到纯酒精中再进行脱水。

    5.浸蜡:石蜡切片法所用的埋藏剂是石蜡。石蜡为提炼石油的副产品,生物制片上所用的是均匀无杂质、熔点较固定的石蜡。石蜡熔点的选择应根据具体情况而定,如果材料较硬,选用熔点较高的石蜡,材料较软,选用熔点较低的石蜡;切片较薄时(在8μm以下)选用熔点较高的石蜡;夏天用熔点较高的石蜡,冬天用熔点较低的石蜡。

    浸蜡过程是使石蜡慢慢进入浸有透明剂的材料中,然后用石蜡完全代替透明剂进入材料组织中。浸蜡方法如下:材料经二甲苯透明后,倒去一部分二甲苯,然后轻轻倒上已溶化的石蜡。倒入的石蜡凝成固体,然后将装有材料的小瓶放在35~37℃温箱中过夜,经一、二天直至石蜡不再继续熔化为止。调节温箱温度到56℃,待石蜡完全熔化后倒去,换三次新鲜纯蜡,每次停留2~5h,使留在组织内的二甲苯全部被石蜡替代。

用过的废蜡可以重新使用,这不仅是节约,而且旧蜡比新蜡更好用,所以必须收回废蜡。收集的废蜡经过熔融过滤等手续即可再用。

    6.包埋:包埋之前,先准备一把镊子,一盆冷水,一个酒精灯及火柴,放在温箱旁。然后准备包埋用的纸盒,纸盒必须用较硬而光滑的纸折成,纸盒大小根据材料的大小及多少而定。

    包埋时将融化的石蜡连同材料一并倾于纸盒内,再将纸盒加满融化的石蜡,然后将镊子或解剖针在酒精灯上烧热,趁热迅速把材料按需要的切面及材料之间的间隔排列好,待石蜡稍微凝固后,将纸盒平放入冷水中,使其很快凝固。总之,包埋手续要尽量迅速,如果石蜡凝固太慢会发生结晶,已结晶的石蜡是不能切片的。

    另外准备一些长方形硬木块,将木块一端先浸渍融化的废蜡,然后将具有材料的蜡块粘在木块上,要注意材料的方向,再用烧热的解剖针烫蜡块与木块的接合处,使其连接牢固,冷凝后再用刀片将材料四周多余的蜡修去。

    7.切片:石蜡切片法一般使用转动切片机。切片时,把切片刀装上,再把木块夹在固着装置上,调整固着装置,使材料的切面与切片刀口平行。调整厚度标志,使所指刻度正适合所要厚度,然后左手持毛笔,右手转动切片机进行切片。左手拿毛笔把蜡带轻轻托住,右手不停摇动切片机,便可得到连续切片。

    8.粘片:蜡片切好后,要粘在载玻片上,这个步骤称为粘片。将彻底洗净的载玻片涂上一小滴粘贴剂,将粘贴剂用小手指涂匀,加几滴3% 福尔马林或蒸馏水,用针或解剖刀轻轻将蜡片放在液面上,然后将载玻片放在温台上。蜡片受热后,慢慢伸直,待完全伸直后,用解剖针把材料在载玻片上的位置放好,再用吸水纸吸去多余的水,放温台上烤干。蜡片背面比较平滑,正面较为粗糙,因此应将背面和载玻片接触,这样粘贴比较牢固。

    明胶粘贴剂的配制:

                    

    先将粉末状的明胶慢慢溶入微温(36℃)的100ml蒸馏水中,待全溶解后,再加入2g石炭酸与15ml甘油,搅拌使完全溶解,然后过滤,储存于有玻塞的瓶中。

    9.染色制片:切片干燥后,可按各种不同的染色法制片。染色前先要经过脱蜡手续。就是将材料外面及渗透到组织中的石蜡溶解掉,溶蜡剂常用二甲苯。步骤是将切片放于纯二甲苯中5~10min,待溶去石蜡以后再转至1/2二甲苯+1/2纯酒精中,然后从纯酒精经各级浓度酒精下降至染色剂溶液的浓度中染色。

    (六)滑走切片法

    滑走切片法是用滑走切片机对植物材料直接进行切片的方法,它适合于对一些较硬的材料,如木本茎、根、枝条等的切片。在作滑走切片之前常须对材料进行软化处理,一般除先用水煮外,可用下列两种方法软化:

    1.甘油一酒精软化法:凡要处理的材料,都应先用抽气机或简易抽气办法除去材料内部的气体,以免妨碍软化剂渗入。也可用水煮法,水煮兼有使木材软化的作用,平常木材约煮1~2h,冷却后再投入甘油一酒精软化剂中(配方:1份甘油 十1份95% 酒精混合)。软化时间视木材性质不同,一星期至数星期。检查软化是否合适,可用刀片切割材料,如较容易切下薄片,则表示软化已好。

    2.氢氟酸软化法:预处理的材料最好先煮2~3h,而且要间歇反复进行,或者连续煮沸(注意随时加水)24 h,冷却后放入市售浓度的氢氟酸(约37%~40%)与水各半混合液中,特硬的材料须用原液浓度。盛装氢氟酸不能用玻璃或陶瓷器皿,必须用特制蜡质或塑料容器,也可在玻璃器内浸涂一厚层石蜡。软化操作最好在通风橱内进行,一个月左右可以软化完全。要检查是否已软化合适时,必须先用流水充分洗涤后才进行切割,并且要戴上医用橡皮手套,绝不能冒味从事。软化好的材料,可放在多孔的小盒中流水冲洗2~3d。

    用滑走切片机切片时,先准备培养皿一个,并装有蒸馏水;毛笔一支,并把要切的材料准备好。切片时先把切片刀固着在切片刀固着器上,然后把材料用二片木片夹着,材料露出木片半厘米,再固着于切片机的固着器上。调好材料高度,使刀刃靠近材料切面,并使材料与刀刃平行。调整厚度调节器,使所指刻度正适合切片厚度的要求后,便可进行切片。切片时用右手扶切片刀固着器,往自己方向拉,材料便被刀切下而附着于刀的表面上。此时用毛笔醮水把切片取下放于培养皿中,然后把刀推回,转动厚度推进器后,再拉切片刀。如此来回推拉,便可获得许多厚度均匀的完整切片。如切坚硬材料,可直接夹在切片机固着器上。柔软材料可先夹于胡萝卜或土豆中再进行切片。

    (七)植物材料的超薄切片技术

    电子显微镜的应用,大大推动了生物学和医学的发展,特别是使细胞学的研究从显微水平发展到亚显微水平。电镜技术和放射自显影、细胞化学等技术相结合,使静态的形态学研究和动态的生物化学研究融汇在一起,为在分子水平上探讨和了解生命活动的奥秘提供了有力的工具。电镜样品制备的好坏往往决定着研究工作的成败,因此,样品制备在整个电镜工作中是极为重要的环节。

    1.取材:用于固定的材料要求切割成1mm3大小的小块。太大固定液不易透入,造成材料内外固定不均;太小则材料受损伤的比例增高。取材时应注意:由于取材要求切的组织块很小,组织受损伤的比例相当大,这无疑会引起细胞代谢的巨大变化,因此,切取后的组织应立即放入固定液中进行固定;植物体大多数部位的组织是由各种类型细胞组成的,因此在取材之前必须对材料所包含的细胞类型有比较清楚的了解,特别注意要使试验和对照的取材严格一致。

    2.固定:做超薄切片时,绝大多数研究工作者都采用戊二醛和锇酸双重固定法,具体步骤如下:

    (1)将材料切成约1mm3的小块,立刻投入用0.2M磷酸缓冲液(pH7.3)配制的2.5% 戊二醛固定液中,于室温下固定2h。(2)倒去戊二醛固定液,材料用0.1M磷酸缓冲液冲洗三次,每次放置30min。(3)用2% 锇酸[以0.2M磷酸缓冲液(pH7.3)稀释4% 的锇酸贮液而成],在4℃冰箱中固定2~4h。(4)用磷酸缓冲液冲洗[同(2)]。

    3.脱水:经戊二醛和锇酸双重固定后并彻底清洗过的材料即可开始脱水。对常用的环氧树脂包埋剂而言,乙醇、丙酮、氧化丙烯作为脱水剂都是比较合适的。脱水要逐级进行,在90% 浓度之前,每级停留的时间可短些,到达90% 浓度之后要适当延长脱水时间。一般可按下列步骤进行:30% 丙酮15min,50% 丙酮15min,70% 丙酮15min,80% 丙酮15min; 90% 丙酮15min;100% 丙酮30min;100% 丙酮30min。

    4.渗透、包埋与聚合:最常用的包埋剂是环氧树脂类,如Epon812、ELR-4206和Araldite,它们的主要区别是粘度不同。包埋剂EponSl2混合物可按下列配方配制:

     
    
    前三种药物按顺序混合后搅拌均匀,然后边搅动边一滴滴加入DMP-30,每加一滴充分搅拌后,再加下一滴,一般要搅拌半小时以上。用环氧树脂作包埋剂时,整个渗透、包埋和聚合的操作步骤如下:

    (1)植物材料转入丙酮∶包埋剂=3∶1的混合物中渗透2h。(2)材料转入丙酮∶包埋剂=2∶2的混合物中渗透2h。(3)材料转入丙酮∶包埋剂=1∶3的混合物中渗透2h。(4)材料转入纯包埋剂中过夜。(5)将材料转入包埋板中,放好标鉴,注满纯包埋剂,放人37℃温箱中过夜。(6)将包埋板放入60℃温箱中聚合24~48h。

    5.切片:将修整好的标本块固定在切片机的样品臂内,然后将做好刀槽的玻璃刀装在刀架上,使样品块的长边在下,使刀成4°~8°的间隙角。调整灯光位置,使成暗场照明,在双目显微镜下选择刀口。锋利部分光缘极细,几乎看不到亮线出现,而刀口有缺陷的部分则因光缘散射出现明显亮线。选好刀口后,将蒸馏水注入刀槽内,使液面水平,刀口润湿。将组织块对准所选用的刀口,先用粗调,后用细调使样品接近刀口。用手动使刀微量推进,同时让样品作上下切割运动,直至切下切片,这时立即启开自动钮,开始正式切片。然后用具膜的铜网将厚度为700?以下的切片沾起,置于培养皿中的滤纸上干燥。

    6.染色:超薄切片的染色是通过某些重金属原子和细胞超微结构结合后,增加了细胞各组分对电子的散射能力,从而提高了标本的电子反差,使标本影像在电镜下看得更为清晰。超薄切片的常规染色方法是采用醋酸铀和柠檬酸铅的双染法。

    (八)显微化学方法

    显微化学方法在研究植物器官、组织和细胞内含物时被广泛应用。植物解剖学中,利用新鲜材料与染色或化学反应方法相结合,一方面用来确定植物细胞壁或内含物的化学性质,另一方面用来分辨细胞的结构。显微化学试验可先用徒手切片法将材料切成薄片,一般应稍厚,大约在20~40μm之间,如果太薄,有时因为所要观察的内容物太少,反而不易清楚地显示结果。

    1.显示纤维素的化学方法

    植物细胞的细胞壁最主要的成分是纤维素。纤维素细胞壁由于碘和硫酸的作用而变成蓝色。在细胞中,纤维素的成分愈多,蓝色愈明显,如强烈木质化的细胞壁,对纤维素虽然仍能发生上述反应,但因它被木质掩盖,因此不能作用,而不变蓝色。

方法是用1% 碘液(配制方法:先将1.5g碘化钾溶于100ml蒸馏水中,待全溶解后,加入1g碘,震荡溶解)滴在材料上,然后再加一滴66.5% 硫酸(7份浓硫酸+3份蒸馏水),经过这样处理,纤维素的细胞壁呈蓝色反应。

    2.显示木质素的间苯三酚反应

    间苯三酚反应是植物显微化学中检验木质化最常用和最简单的方法。切片先用一滴盐酸浸透(因间苯三酚在酸性环境下才能与木质起作用),然后滴上一滴间苯三酚的酒精溶液(5%~10% 在95% 酒精中)。木质化细胞壁可现出樱桃红或紫红色。它们的颜色深度决定于细胞壁木质化的程度。此染色法不适于作永久切片,因颜色会慢慢退去而变成淡黄色。

    3.显示淀粉粒的碘一碘化钾反应

    淀粉是植物细胞中主要的储藏物质,它们在各种不同的植物细胞中形成各种不同形状的颗粒。一般说来,淀粉本身具有特殊形状和光学特性,不必用专门化学方法来检验。由于碘与淀粉作用形成碘化淀粉呈蓝色反应,因此用碘液测试淀粉已成为最常用的方法。

    碘液的配制:先将2g碘化钾投入5ml蒸馏水,加热使之完全溶解,然后溶入1g碘片(结晶),再用水稀释至300ml。将配好的溶液放入棕色玻璃瓶中,保存在暗处。用时最好再将此试液稀释2~10倍,否则会将淀粉粒染色过深。

    4.显示多糖的高碘酸一希夫反应

    利用高碘酸(氧化剂)破坏多糖分子中的C--C键,变为醛基,醛基与希夫试剂(无色亚硫酸复红)相结合,生成红色的反应产物。这一过程称为PAS反应。

    试剂配制

    (1)0.5%~0.8% 高碘酸水溶液

    (2)希夫试剂:将1g碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中,摇动5~10min,冷却到50℃时过滤。向滤液中加入1M盐酸20ml,冷却至25℃,加2g偏亚硫酸钾(或钠盐),摇匀,静置暗处过夜。加活性炭2g,摇动2~3min,用滤纸将溶液过滤于棕色细口瓶中。滤液应该是无色或淡黄色,若呈红色则不能使用。将合格的染液置于黑暗低温(0~4℃)下贮存备用。用前将染液升到室温。根据前人的经验:使偏亚硫酸钾2~3倍于碱性品红,可增强希夫试剂活力。在提高偏亚硫酸钾用量的情况下,可使碱性品红变成无色,不用活性炭去色过滤。

    (3)洗涤液一偏亚硫酸钾(或钠)溶液

        

    临用时将三者混合,使用新鲜混合液。

    制片程序

    (1)切片脱蜡到蒸馏水。(2)流水冲洗15~30min。(3)0.5%~0.8% 高碘酸溶液处理10min。(4)流水洗涤5~10min,蒸馏水过渡。(5)移入希夫试剂中20~30min。 (6)用偏亚硫酸钾溶液洗三次,每次2~3min。(7)流水洗涤10~15min,并通过蒸馏水5min。(8)按常规通过各级乙醇脱水,二甲苯透明,树胶封片。

    5.显示蛋白质的汞一溴酚蓝法

    蛋白质是构成原生质体的主要成分,也可成为后含物储藏在细胞内,成为无定形的、结晶体或糊粉粒。目前测定糊粉粒最普通的方法是氯化汞一溴酚蓝法(试剂配制:10g氯化汞(HgCl2),0.001g溴酚蓝溶于100ml蒸馏水中)。
    将切片滴上此液一滴,染色5min后用0.5% 醋酸冲洗,除去切片上多余的染料, 再放在培养皿中水洗5min,用甘油封藏观察。细胞中有糊粉粒则被染成鲜蓝色。

    6.显示油、脂肪、挥发油的化学方法

    植物解剖中,染脂肪性物质最常用的是苏丹Ⅲ溶液,它有二个浓度不同的配方:

            

    切片放在上述任一种溶液中染色24h,然后用50% 酒精洗涤,放入甘油中观察,油脂可染成淡黄或红色,同时为了加速染色,可以微微加热。

    7.显示单宁的亚硫酸铁反应

    单宁是一类酚类化合物的衍生物。许多植物细胞中都含有单宁,它存在于细胞质、液泡或细胞壁中。单宁被认为具有保护植物,抗水解、抗腐烂和动物危害的作用。

    将新鲜组织切片投入0.5%~1.0%的亚硫酸铁或氯化铁溶液(用0.1M HCl配制)中染色后,可作暂时性封片进行观察;也可经酒精脱水,二甲苯透明,制成永久制片。染色结果:若出现蓝色沉淀物则表明单宁存在。

    8.显示DNA的孚尔根反应

    利用切片经1M HCl 60℃水解处理后,DNA的脱氧戊糖间的醛基成为自由状态。希夫试剂同暴露出来的醛基发生反应,将核的染色质染成深紫红色。

    试剂配制

    (1)1M HCl。(2)希夫试剂配法见“多糖的高碘酸-希夫反应”。(3)偏亚硫酸钠水溶液(洗涤液) 配方见“多糖的高碘酸一希夫反应”。

    制片程序

    (1)组织经卡诺固定液固定4~8h,固定时间不宜太长,太长会水解DNA,减弱染色强度。(2)切片脱腊并逐步过渡到蒸馏水。(3)在冷1M HCl中1~2min。(4)60℃热1M HCl处理15min。(5)用冷1M HCl略洗。(6)蒸馏水漂洗。(7)希夫试剂反应1~2h(暗处)。(8)用偏亚硫酸钠水溶液洗三次,每次3~5min。 (9)流水冲洗15~30min。(10)蒸馏水漂洗。(11)各级酒精脱水,每级10~15min。到95% 酒精时,可用0.1% 亮绿(或固绿)的 95%酒精溶液复染15~60秒。(12)二甲苯透明,树胶封片。

五、显微结构图的绘制

    植物形态解剖学的学习和研究工作中,经常需要以绘图形式将显微镜下所观察的内容记录下来。绘图要求具有严密的科学性,能够真实、准确反映观察和研究材料的主要结构特征。成功的显微结构图不仅可以代替繁琐的文字描述,而且比较直观,易懂,这是文字叙述所不能达到的。因此,显微结构图的绘制在植物解剖学的学习和研究中被广泛应用。

    怎样才能将显微镜下的结构图描绘清晰而且真实,并具有科学性? 关键是要养成耐心细致、严肃认真、勤于思考的科学态度,同时,还应做到以下几点:

    1.实验前认真学习理论知识,搞清实验课要观察内容的各部分结构。

    2.绘图时要用4H以上绘图专用的硬铅笔,笔尖要削得尖而适当,以保证图面清晰。如果要多幅图绘在一张纸上,绘图前应合理布局,力求页面整齐。为了能够清晰表示出显微镜下观察到的结构,应适当将结构图放大。在每个图所布局的范围内,图应画在稍偏左侧的位置,图中各部分构造的图注应放在右侧,用平行线引出,平行线末端要齐,注字要工整,图的名称要注在图的正下方,并表明图号和放大倍数。

    3.图各部分的位置和比例必须与显微镜中实际观察的各部分位置及比例相一致,并能正确描绘出植物各器官组织、细胞的形态特点,切忌千篇一律,一个笔调描绘,看不出各部分细胞形态和结构的区别,失去图的形象性。

    4.用绘制的图表明细胞及组织的显微结构,与显微照相不同,它不是有什么画什么,而是经过反复观察后,抓住主要矛盾,突出重点,画出构造中最本质、最典型的部分,抛弃次要和偶然内容的干扰。同时还应不失图面的真实性,要依据实际观察到的图像绘画,不要凭假想,也不要单纯以书本照抄、照画。

    5.显微构造图的描绘,不同于美术绘画,美术绘画常以密线条或疏线条涂抹阴影的方法表示色深、暗或色淡、明亮。而显微结构图只能以铅笔尖垂直于图纸所点小点的密集与稀少表示内容物的稠密与稀疏,点要垂直点,切勿带出尾巴。

    6.画图时要注意养成正确的姿势和习惯。要用左眼投向显微镜视野,一边用左眼看所要绘制部分的构造,一边用右眼看着手中铅笔进行描绘。这样绘出的图像容易做到接近实际,也较为真实。

    7.正确的绘图步骤:以描绘一个洋葱细胞的构造为例,当选好所确定的描绘细胞后,首先要在显微镜中目测出细胞长度和宽度比例,并在图纸上草拟出长与宽的大抵界限(图2-1A),再以轻线条草拟出细胞的一股形状及与相邻细胞间的联系(图2-1B),进一步以轻线条绘出细胞核、核仁、液泡所在部位的轮廓图(图2-1C);最后对照显微镜下所观察到的实际图,检查初步草拟轮廓图所规定的各部分比例,看看图像是否接近实际并做最后的修正,用坚定、准确、清晰的线条做最后的描绘,并予以正确的图注(图2-1D)。

图2-1 显微结构图的绘制步骤
1. 细胞质;2. 核仁;3. 细胞核;4. 液泡;5. 细胞膜;6. 细胞壁

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