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试论胚胎移植及其成功率的影响因素
作者:张丽君 李…    文章来源:辽宁省种牛繁育中心    点击数:7639    更新时间:2007/8/8
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胚胎移植技术是继人工授精技术之后,人类成功地将生物技术广泛应用到家畜繁殖生产进程中的又一里程碑。自二十世纪五十年代,人工授精技术被推广以来,优良种公畜的高生产性能在畜群中得到了最大限度的发挥;二十世纪七十年代,胚胎移植技术的推广和应用,又使得优良母畜的繁殖潜力得到充分的发挥。在我国这项工作起步虽然晚些,但进展很快, 二十世纪九十年代中期已进入了推广阶段,牛、羊的胚胎移植已向胚胎工程和产业化方向发展。尤其是近年来随着我国牛、羊业的大力发展,仅仅依靠母畜的常规繁殖,已无法满足畜群数量的增加和生产性能提高的需求。优良种畜尤其是母畜的严重缺乏已成为牛、羊业发展的瓶颈。因此越来越多的畜牧生产经营者和管理者已充分认识到应用胚胎移植技术的迫切性。胚胎移植已成为一项蓬勃兴旺的朝阳产业。但由于一些因素的制约使得这一事业的快速发展受到限制。例如胚胎的来源匮乏,成本及技术服务的费用过高等都制约这项技术的广泛应用,但是从事此项工作的技术人员的缺乏和技术水平的不尽人意才是此项事业发展的最主要的限制因素。

胚胎移植是一项家畜群体生物技术,远比人工授精复杂。只有具有一定理论基础和丰富繁殖实践经验的人,经过成百上千次的重复操作实践,才能熟练掌握此项技术,胜任此项工作。现结合有限的实践体会,谈谈影响胚胎移植受胎率的因素。

若想较全面、系统地了解胚胎移植及其成功率的影响因素,必须首先了解胚胎移植的生理学基础、胚胎移植的基本原则以及家畜妊娠的确立等家畜繁殖知识。

1 胚胎移植的生理学基础

1.1发情后生殖器宫的孕向发育。牛同大多数自发排卵的动物一样,发情后不论是否配种或配种后是否受精,生殖器宫都会发生一系列变化,如卵巢中黄体的形成,孕酮的分泌及其高水平的维持,子宫内膜组织增生和分泌机能的增加等,为妊娠做准备,这种生理现象即是母畜发情后生殖器宫的孕向发育。也就是说,发情后的最初一段时间里(周期性黄体期),母畜无论受精与否,生殖系统均处于相同的生理状态之下,此时进行胚胎移植,不配种的受体母畜可以接受胚胎并为胚胎发育提供所需各种条件,胚胎就会继续发育成长。

1.2早期胚胎的游离状态。胚胎在发育早期的相当一段时间内(附植前),在输卵管或子宫处于游离状态,因此可以脱离母体而被取出,并可在体外短时间内和适宜的条件仍能存活,当移入与供体牛生理状态相同的受体牛输卵管或子宫角中能够继续发育。

1.3胚胎的遗传特性。胚胎的遗传特性(基因型)是由供体决定的,受体为胚胎的继续发育提供营养及其环境条件,对胚胎不产生遗传上的影响。

1.4 免疫耐受性。受体母畜的生殖道(子宫或输卵管)对于具有外来抗原物质的胚胎,一般来说,在同一物种内有耐受性,不发生排斥现象。所以胚胎被从一个个体转移到另一个体,可以被保留并存活下来。

2 胚胎移植的基本原则

由于家畜具有以上的生理学特性才使得胚胎移植成为可能。而要保证胚胎移植成功并实现其价值,我们的所有操作和实践活动必需遵循以下基本原则:

2.1确保胚胎在移植前、后所处环境的同一性。

2.1.1供、受体在动物分类学上的相同属性,即二者属于同一个物种。

生理上的一致性。即受体和供体在发情时间上的同期性(同步差要求在±24小时之内)。

2.1.3解剖部位的一致性。胚胎在被移植前后所处的解剖部位的相似性。

2.2胚胎移植的期限。胚胎采集和移植的时间(胚胎的日龄)不能超过周期黄体的寿命。通常是在供体发情配种后的3~8天内采集并移植。

2.3胚胎的质量。胚胎具有正常的发育能力才能被移植,并保证其在操作全程免受任何有害因素的影响而降低乃至丧失生命力。

2.4供、受体的状况。

2.4.1生产性能和经济价值。供体的生产性能要高于受体的生产性能,这种差异越大,越能体现胚胎移植的价值。

2.4.2整个机体生理状态。供、受体牛应健康,无疾患,营养良好,体格健壮,特别是生殖系统的各器官具有正常的生理机能,否则会影响移植的效果。

3 家畜妊娠的确立

胚胎由输卵管进入子宫,并在子宫内发育成新个体是一个复杂的生理过程。其中两个重要的环节就是妊娠识别和着床。

3.1妊娠识别 妊娠初期,胚胎发出信号(分泌类固醇激素或蛋白质),并传递给母体,母体随即产生一系列反应,以维持黄体的存在,使周期性黄体转变为妊娠黄体,整个生殖系统向有利于妊娠的建立和维持的方向发展。胚胎与母体建立妊娠联系的过程就是妊娠的识别。

3.2着床 胚泡(囊胚)在子宫内的初期是处于游离状态。随着胚泡不断发育,泡内液体的不断增加,滋养层细胞逐渐与子宫内膜建立组织和生理联系,这个过程叫胚胎附植,也叫着床。

牛的妊娠识别和胚胎附植的大致时间分别在排卵后的16~17天和40~45天(紧密附植)。

妊娠过程涉及胚胎、子宫和黄体之间的一系列协调关系,所以影响胚胎移植成功率的因素是多方面的,而且各种因素又相互制约。

4 胚胎移植成功率的影响因素

4.1胚胎 胚胎是胚胎移植活动中的主体。胚胎具有继续发育的能力是胚胎移植成功的先决条件。

4.1.1胚胎的质量 正确鉴定胚胎的质量,保证所移植的胚胎具有正常的发育能力,是移植能否成功的关键之一。目前胚胎质量和活力的鉴定主要有形态学、培养、荧光和测定代谢活性四种方法。其中形态学方法简单易行是实践中常用的方法。因为胚胎不像精子那样具有活动能力,其活力是借助实体显微镜所观察到的内、外部形态进行综合评定的。形态学方法带有一定程度的主观性,但只要操作人员具有一定的经验,并严格按着胚胎等级的标准鉴定胚胎,还是相当可靠的。ZDTS将胚胎分为A、B、C、D四个等级,A、B级胚胎可以超低温保存,C级胚胎只能做鲜胚移植,D级为不可用胚胎。胚胎的等级越高,对环境不利因数的耐受力越强,对受体母牛发出的信号越强,发育成胚胎的潜力越大,移植的受胎率愈高。

4.1.2胚胎的来源 胚胎的获得有两种途径,一是卵子和精子的结合是在体外环境中完成的,即体外胚;另一种则是体内胚。体外胚的生产是解决胚胎成本高、来源匮乏的有效办法。但经卵母细胞的体外成熟、体外受精以及早期胚胎的体外培养所获得的体外胚胎与通过超数排卵技术在体内完成受精所获得的体内胚胎相比发育潜力明显低,移植后的受胎率也低。目前,体外胚的受胎率一般在10%~30%之间。

经胚胎超微结构的研究表明,牛体外受精胚胎的细胞间连接数量明显少于体内胚胎,内细胞团的细胞之间的紧密程度低于体内胚胎,卵裂球的胞质中出现高度的囊泡化,这被人们普遍认为是体外胚妊娠率低的主要原因。但是随着体外受精技术和其他配套技术的不断完善,尤其是牛活体采卵技术的应用,体外胚移植效率将得到很大的提高。

4.1.3胚龄 牛非手术采卵大都在发情后的第7天(6~8天),胚胎移动到子宫角时进行子宫胚胎采集。获得的胚胎胚龄为7(6~8)日龄,这时的胚胎处于桑椹或囊胚期。由于囊胚期胚胎的内细胞团细胞数量多,细胞对不良环境因素的耐受力强,进一步发育的潜力要比桑椹期胚胎大,因此在早期胚胎的体外培养体系中大都以囊胚发育率作为衡量胚胎培养效率的指标。总之,在供、受体牛发情相应同期的情况下,囊胚移植妊娠率要比桑椹胚的要高。

4.1.4胚胎的冷冻保存 胚胎超低温保存以及解冻的技术已相对成熟,但冷冻和解冻的过程对胚胎的细胞仍有伤害。在操作合理的情况下,冷冻和解冻后的胚胎存活力下降20%左右。如牛鲜胚移植的受胎率50%左右,而冻胚的移植受胎率则为40%左右。尽管如此,胚胎的冷冻保存仍是胚胎移植不可缺少的技术环节之一,它可以使胚胎移植不受时间和空间的限制,从而使胚胎移植技术的应用更具广泛性。

4.1.5胚胎的数量 一般情况下,一头受体牛一次只植入一枚合格胚胎,但如果有两枚负C级胚胎,也就是说,这两枚胚胎发育潜力不大,但又有进一步发育的可能,如果将它们单独移入,则发育成胎儿的可能性很小,但将它们同时植入一头受体牛子宫内,其发育成一个甚至两个胎儿的机会就大大增加了。理论上的依据是两枚胚胎与一枚胚胎相比向受体母牛传递信息的生物信号更强,胚胎与母体之间易建立妊娠联系,所以受孕机会大。

4.1.6胚胎的发育潜力 胚胎的发育能力一般可由形态学鉴定来确定。但除了形态正常之外,胚胎发育的潜力也是胚胎能否存活并继续发育的重要因素。经研究发现,胚胎的发育潜力与供体母牛的生殖能力有密切关系。即生殖力正常的供体牛不仅其超排效果好,且其胚胎发育潜力要比低生殖力(不宜受胎的)母牛的大。

4.2受体牛 受体牛是接受胚胎的母体,被植入其体内的胚胎存活所需的免疫环境、继续发育所需的营养环境都是由它来提供的。所以,受体牛的质量好坏直接影响胚胎移植成功率高低。

4.2.1受体牛与供体牛发情同期化程度 受体牛与供体牛发情是否同期,也就是受体牛的发情后天数与胚胎日龄是否同步,是胚胎移植成功的关键因素。同期化程度或同步程度越高,胚胎移植成功率越高(一般差异不超过24小时)。因为子宫只允许同步胚胎发育而对非同步胚胎有毒害因素;另外不同步胚胎被移植前后所处的生理环境不同,不能存活也不能向子宫发出它们存活的信息。那么两者之间不能建立妊娠联系,不能着床。

4.2.2受体牛的黄体状况 黄体是卵泡成熟、破裂、排出卵母细胞后,在原处由颗粒细胞增生形成的暂时性分泌组织。它是卵巢排卵的标记,也是分泌孕酮——维持妊娠所必须的激素之一的组织。所以,胚胎移植时受体牛黄体的发育状况直接影响移植妊娠率。

黄体质量的判断,不同的人有不同的感觉和经验,一般根据黄体的大小、形状和弹性来判断。另外,胚胎植入与黄体处于同侧的子宫角比植入对侧子宫角,受胎率要高。

4.2.3受体牛的子宫、卵巢的生理状况 受体牛的子宫是胎儿整个发育过程的场所,所以子宫的健康环境和机能状况直接影响胚胎的着床和胎儿的正常发育。而卵巢的生理状况决定着维持正常妊娠所需要的多种激素水平的平衡。在实践中,主要以子宫和卵巢的大小、形状和弹性来判断。

4.2.4受体牛的孕酮水平 受体牛体内孕酮水平和变化指标可以直接反映母牛妊娠环境的好坏。上面所述的黄体的质量等的检查都是通过直肠检查,凭感觉来判定的。一方面需要实践经验的积累,另外其准确性也受到限制。通过放免(或酶免)的方法鉴测受体牛乳(或血)中的孕酮的水平变化,来判断牛的发情和黄体的状况更科学。在实践中,如果将两者结合起来就会更理想。

4.2.5受体的营养和健康状况 健康和营养状况良好是母牛拥有正常繁殖的前提和基础。家畜的所有繁殖活动、生殖器官或组织的变化、各种激素的合成、分泌和调节以及神经传导都要依赖物质和能量的积累和正常机能的具备。而体况(膘情、北毛的光泽等)是牛的营养和健康状况最直观的反映,所以体况良好的母牛才能被选作受体牛。

4.2.6泌乳 泌乳活动不仅与母牛下一轮繁殖的发情、排卵、受胎、妊娠争夺营养和能量外;维持泌乳所必需的促乳素也抑制卵泡发育、妊娠所必需的雌激素、孕激素的合成和分泌。处于哺乳期的母牛如果被选作受体牛,应尽快断奶,以提高其发情、排卵和移植后妊娠的比率。

4.3其它因素

4.3.1技术人员的操作 技术人员的正确操作是胚胎移植成功的前提和保证。室内人员必须最大程度地控制环境条件,比如周围空气的温度、湿度、清洁度;处理胚胎的液体的温度、渗透压以及暴露在外界的时间长短等等,这些因素都直接作用于胚胎,对其细胞产生不同程度的伤害。 所以避免或减少外界有害因素对胚胎的伤害是室内人员操作的基本原则。

室外人员的移植操作是胚胎移植的最后一个环节。操作者的熟练程度、移植位置、内膜破坏程度、移植器械和生殖道的相对无菌程度等等这些都对胚胎移植的结果产生影响。

4.3.2季节 现在的肉牛、奶牛品种基本都是全年发情。但是温暖、湿润、饲草充足的季节无疑更适宜母牛繁殖,这时进行胚胎移植,受胎率相对也会提高。季节对家畜繁殖的影响,实际上是由于季节变化而带来的饲料、光照、舒适度等对家畜产生生理影响(包括营养储备、生殖内分泌轴的调节等),从而影响它的发情、排卵、以及受孕。

胚胎移植涉及的技术环节非常多,任何一个环节的疏忽都会导致移植的失败。只有认真、规范地完成好每一个细节,以排除对胚胎有不利影响和阻碍妊娠建立的一切内,外因素的影响,才能保证较高的移植成功率。

http://www.lnznzx.com/new/mainland.asp?Title=109

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