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近年来哺乳动物细胞核移植的相关进展(2004)
作者:未知    文章来源:http://www.bioon.com    点击数:2325    更新时间:2007/8/8
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引言

    一个精子和一个卵子的结合(即受精),恢复二倍体,从而开始了一个个体的发育。在胚胎发育过程中,很多不同类型的细胞都是由受精卵发育开始的。它们有一些专门发育为肌肉细胞,有一些发育为神经细胞,还有发育为血细胞等。从这里就引出了一个问题:在哺乳动物胚胎发育过程中,细胞发生了分化,但是在适宜环境下,已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态,再重新发育成其它类型细胞组织的多能性,甚至发育成完整个体的全能性呢?细胞的分化是不是发生了不可逆的变化?为了回答这个问题,早在1938年,德国著名胚胎学家Spemann提出了将发育后期的胚胎核移到无核的卵子中使其重新发育的设想,实验的目的就是为了检验部分分化或完全分化细胞的全能性。他通过头发结扎将蝾螈的受精卵一分为二,有核部分可正常发育和卵裂,并发育到16细胞期,无核部分当移入另一个卵裂球的细胞核时,也能发育成为正常的幼虫,证实了蝾螈未分化的卵裂球具有发育的全能性。1952年,Briggs和King等将已发生了分化的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵,构建核移植胚,最后发育出了完整的蝌蚪。这是首次进行的细胞核移植尝试获得成功。Gurdon等(1962)利用原肠期内胚层细胞进行核移植,分别产下可育爪蟾。由此证明:自原肠胚以后的细胞仍然没有发生不可逆的改变,可以支持核移植胚发育到成体。这些实验结果证实,两栖类等低等动物至少有部分已分化的体细胞在卵母细胞质的作用下,可以恢复其全能性而重新发育到成体。这也为哺乳动物核移植奠定了基础。

1哺乳类动物细胞核移植研究进展

1.1哺乳类动物胚胎细胞核移植研究进展

    哺乳动物核移植研究始于1975年,研究远远晚于两栖类动物,其主要原因是由于哺乳动物的受精在体内发生,而且哺乳动物早期胚胎的体外培养(In Vitro Culture, IVC)技术和早期胚胎显微操作技术在当时没有建立起来。牛津大学Bromhall(1975)将兔子的胚胎细胞核移植到未受精的卵母细胞内,部分可发育到囊胚阶段,但成功率相当低。由于不能进行染色体和供体特异性标记分析,因而这些发育的胚胎来源是否是注入的细胞核,或者是胚胎自身的细胞核都不能作一清楚的解释。鉴于当时的哺乳动物核移植理论和技术都尚未完善,人们大多将研究的重点放在了卵裂球的分离和胚胎切割上。然而,由于胚胎分割和卵裂球分离技术本身的局限性,动物克隆的数量非常有限,未能达到人们所希望的预期效果,于是人们一直也在探索动物核移植的克隆方法。在1981年, Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)的细胞核移植到去核的受精卵内,获得了首批克隆的小鼠。这是世界上首次获得哺乳动物克隆成功的报道,但是其实验未被其他的研究人员所重复,人们仍对核移植技术仍缺乏信心。直到1983年这种局面才被Mcgrath和Solter打破,他们首次利用显微操作技术和细胞融合技术,将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植,得到了产仔,并建立了重复性很高的核移植程序,使得核移植效率大大提高,人们对核移植技术的应用前景看到了希望。随着核移植技术程序的建立,哺乳动物细胞核移植的研究发展很快。1986年,Willadsen等用绵羊早期胚胎的卵裂球作供体,用去核的第二次减数分裂中期(Second Meiotic Metaphase, MII)卵母细胞作受体,并用电融合的方法代替了仙苔病毒诱导供体卵裂球与去核卵母细胞融合,研究发现电融合方法比病毒融合法更有效,核移植胚胎的体外发育能力更强,重组胚移植后获得了核移植后代,这是首次在家畜上获得了成功。他们的实验阐明了哺乳动物胚胎细胞核移植中两个全新的观念:(1)作为核受体,卵母细胞比受精卵有更大的优越性;(2)绵羊桑椹胚的细胞核具有发育的全能性,并建立了以早期胚胎卵裂球为供体, MII期卵母细胞为受体胞质以及用电融合方法诱导供体细胞核和受体胞质融合这一整套技术。该技术极大推动了核移植技术的发展,并成功运用于其它动物,获得了胚胎克隆牛(Prather et al, 1987)、兔(Stice & robl, 1988)、猪(Prather et al, 1989),和猴(Meng et al, 1997)等。虽然胚胎细胞核移技术的发展总体相似,但是各动物胚胎细胞核移植的发展过程是有所不同的,下面将分别对各种哺乳动物的胚胎细胞核移植技术研究进展作一简单的概述。

1.1.1小鼠

    小鼠的胚胎细胞核移植的研究开展较早,也是最早获得了核移植后代。1981年,Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的ICM细胞核移植到去核的受精卵内,获得了首批克隆小鼠。1983年,Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术,将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植,得到了产仔,并建立了重复性很高的核移植程序,使得核移植效率大大提高。除了这些取得突破的研究外,Hoppe和Illmensee(1981)的研究证明了孤雌生殖胚胎的ICM细胞含有发育个体所需的所有基因,这些细胞具有发育的全能性。在细胞周期的调整和核质互作上,Cheong等(1993)发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体细胞质中可以发生发育程序的重排,核移植胚胎的发育率明显提高,并获得了核移植后代。1996年,Kwon和Kono等通过改进方法,获得了4个和6个遗传上完全相同的继代核移植后代。另外有研究表明,小鼠囊胚期的滋养层细胞与ICM细胞一样具有发育的全能性(Tsunda & Kato, 1997; Sotomaru et al., 1999)。

1.1.2 牛

    实验动物中的胚胎细胞核移植研究为家畜的核移植研究奠定了扎实的技术基础。而在家畜中,牛的胚胎细胞核移植研究的历史较为久远,研究的投入是最大的,也取得了丰硕的成果。1987年,Robl等首次进行牛的核移植研究,他们将1-8细胞期胚胎的细胞核移到去核的合子内,结果1-细胞期胚胎的细胞核移植后构成的重组胚可以发育到出生,而处于其它细胞期的胚胎细胞核移植后均不能支持重组胚发育超过4-细胞期。同年,Prather等(1987)用Willadsen相同的核移植技术程序(Willadsen, 1986),将16-32细胞期胚胎的卵裂球移入去核的体内或体外成熟卵母细胞内,最后出生了1头核移植牛犊,其成功率为1%。Bondioli等(1990)用16-64细胞期胚胎作核移植供体,获得了7头来自同一核供体胚胎表现型的牛犊,移植的成功率达20%。Stice和Keefer(1993)获得了54枚来自同一供体胚胎的克隆胚胎,其第一、二、三代克隆胚胎移植后均产下了牛犊。Ector等(1995)克隆与再克隆囊胚发育率(12.9%与14.9%)和妊娠率(35.7%与33.3%)没有差异性。而Heyman等(1995)用体外受精(In Vitro Fertilization, IVF)胚胎作为核移植供体,核移植胚胎的囊胚发育率达到了22.6%,这与体内胚胎作为核移植供体核的囊胚发育率相似(30.2%)。而在国内这方面的研究也取得了进展,李雪峰等(1996)成功的获得了我国第一头胚胎克隆牛。

1.1.3猪 

    1989年Prather等利用合子间的原核交换,并利用电脉冲使供体原核和去核合子融合,得到了7头仔猪,而利用2-8细胞期胚胎的核融合去核的MII期卵母细胞,体内移植后形成11%的桑椹胚,移植88枚核移植胚胎至受体母猪仅生下了1头仔猪,成功率不到1%。因此后来的研究也着重转向影响猪胚胎细胞核移植的因素。同牛一样,猪的核受体卵母细胞既可用体内成熟的也可用体外成熟的(Prather et al., 1991)。但由于当时卵母细胞的体外成熟培养系统还不够完善,使得体外成熟卵母细胞质量较差而不能完成胚胎的体外发育全过程(Nagashima et al., 1992)。Prather等(1990)在研究发现,猪核移植胚发生了发育程序的重排,出现供体核膨胀,并认为核的膨胀程度与卵裂球的发育时期无关。在猪卵母细胞激活上,研究表明:采用合适的场强1次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,增加脉冲次数并不能提高激活率(Prather et al., 1989; Prochazka et al., 1992; Nagashima et al., 1992; 赵浩斌等, 1999)。而在胚胎发育的早期阶段基因表达和蛋白质合成研究中,也有了初步的成果。Schoenbeck等(1992)研究表明猪胚胎基因组从4细胞期的16h开始控制发育,Prather 和 Rickords(1992)的研究发现RNA的合成与加工始于4细胞期的24h,并认为卵母细胞质对核的重排不受母体-合子转变(Maternal to zygota transition, MZT)的影响。Parry和Prather等(1995)将8-细胞期胚胎的卵裂球融合于去核MII期卵母细胞内,发现在核移植胚胎上发现有51KD的蛋白质带,并证明了蛋白质是由胚胎卵裂球带入的RNA所合成的。

    我国窦忠英(1997)和赵浩斌等(1997)用与Prather等(1989)相同的方法得到了克隆猪。

1.1.4 兔

    兔子胚胎细胞核移植研究起始于1975年,Bromhall等首次将兔桑椹胚的卵裂球细胞注入到成熟后激活的卵母细胞内,得到了发育的囊胚。Stice和Robl(1988)用电融合方法将8-细胞期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内,获得了世界首批6只基因型完全相同的核移植兔。随后Collas和Robl(1990)改进电激活和电融合技术,以16-细胞期胚胎细胞核为供体核,230枚重组胚移植后有23只仔兔出生,这是到目前为止效率最高的报道。Collas和Robl在兔的细胞核移植上的贡献特别大。他们的研究为以后的体细胞核移植奠定了基础。他们在兔核移植胚胎细胞核质同步对核移植的影响以及供体核形态结构变化上进行了详细的研究,得出了如下的研究成果:随着供体胚胎的发育,胚胎卵裂球构建的重组胚发育力下降,囊胚期ICM细胞构建的重组胚仍可发育到囊胚,而滋养层细胞构建的重组胚发育阻滞于8-细胞前,供体细胞核的形态重塑对核移胚的发育有利(Collas & Robl, 1991)。G1期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内时,重组胚发生早熟性染色体凝集(Premature Chromosome Condensation, PCC),中期染色体和纺锤体形态正常,核移植胚的囊胚率发育率也高,而早S期和晚S期的卵裂球移入MII期去核卵母细胞时,中期染色体和纺锤体出现异常,核移植胚胎的发育率降低(Collas et al,1992a, b)。在Collas和Robl(1991)的研究理论指导下,Yang等 (1992b) 将采集的8-细胞期胚胎经体外培养20~24h发育到32-64细胞期后的卵裂球再用作核移植的供体细胞核,获得了8只仔兔,证明了体外培养到32-64细胞期的胚胎仍具有发育的全能性。黄少华等(1993)首次实验证明,兔冷冻-解冻胚胎也能进行核移植,其结果与新鲜胚胎的的核移植胚在激活率、融合率及分裂率上无显著差异。之后,我国科学家王斌等(1995),周琪等(1996, 1999)也获得了胚胎细胞核移植兔。在兔核移植研究中一般体内成熟的卵母细胞作为受体胞质,Park等(1998)尝试了用体外成熟14h的卵母细胞进行核移植,发现用兔体外成熟卵母细胞同样可以获得核移植后代。

    关于兔继代核移植报道较少。1995年,周琪等获得了第三代继代核移植兔胚。1998年,Rao等尝试用冷冻保存的兔核移植胚胎进行继代核移植,得到了继代核移植囊胚,但未得到后代。Piotrowska等(2000)用兔8细胞胚胎卵裂球进行继代核移植,发现重组胚的发育率无影响,将第三代继代核移植重组胚移入受体后获得了克隆个体。

1.1.5羊

    绵羊是继小鼠后第二个获得核移植后代的哺乳动物,也是最早获得核移植后代的家畜。早在1986年,Willadsen用8-16细胞期的胚胎作为核移植供体,首次用去核的MII期卵母细胞作为核移植受体,并用电融合方法代替仙苔病毒来诱导供体卵裂球细胞与受体胞质相融合,获得了核移植后代。该方法成为以后核移植的常规方法,为以后其它家畜胚胎细胞核移植和体细胞核移植的成功奠定了技术基础。随后Smith和Wilmut(1989)用绵羊16-细胞和ICM作为核移植供体,采用该方法进行核移植,都得到了活的后代,该研究首次证明了绵羊ICM细胞仍具有发育的全能性。Pugh等(1992)的研究表明,绵羊体外成熟卵母细胞可用于构建核移植胚胎。1997年,Liu等在研究供体细胞与卵母细胞周期的协调性对核移植胚胎体外发育的影响发现,M期卵裂球移入MII期卵母细胞可以提高核移植胚胎的发育率(Liu et al., 1997)。

    在国内,山羊的胚胎细胞核移植在国际上一直处于领先地位。1991年,张涌等利用4-32细胞胚胎卵裂球作为核移植供体,去核的MII期卵母细胞作受体,构建的重组胚胎移植后出生了世界首批核移植山羊5只,这是我国在哺乳动物细胞核移植上的首次获得成功。1995年,邹贤刚等通过胚胎继代核移植的方法获得了山羊4只。

1.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展

    Gurdon等(1962; 1975)用爪蟾,Diberardino & Orr(1992)用蛙分化的细胞进行核移植都得到了蝌蚪,证实了在两栖动物上至少部分已分化的细胞具有发育的全能性,细胞分化后在基因组上没有发生不可逆的改变,基因组上存在重新启动发育所需的所有基因,这一理论为哺乳动物体细胞核移植研究奠定了理论基础。Czolouska等(1984)的研究表明已分化的小鼠胎儿胸腺细胞移植到激活的卵母细胞后可以发生形态重塑,形成原核样结构,推测体细胞能够支持胚胎的发育。后来,Kono等(1991)报道了用小鼠胸腺细胞核移植后得到了发育的囊胚,但移植后未获得分娩的核移植小鼠。由于当时普遍认为哺乳动物的细胞分化在遗传结构上发生了不可逆的改变,部分基因发生缺失,进而失去了发育的全能性,这些研究结果未引起人们的重视。直到1997年,Wilmut等得到了举世瞩目的第一只成年体细胞核移植绵羊—Dolly后,体细胞核移植才受到广泛的关注,人们才开始重新认识细胞分化的本质以及细胞分化的理论基础。当然,人们对“Dolly”羊也提出了置疑,但DNA指纹分析证明了Dolly的确来自成年绵羊乳腺上皮细胞(Ashworth et al., 1998; Signer et al., 1998),后来众多的体细胞核移植的成功充分肯定了该研究的结果(Schnieke et al., 1997; Wakayama et al., 1998; Bulter et al., 1998; Shiga et al., 1999; Lanza et al., 2000b)。Dolly的出生,使哺乳动物核移植研究进入了一个崭新的阶段,Wilmut等建立的一整套绵羊体细胞核移植程序,如恢复体细胞核全能性的“血清饥饿法”,体细胞传代阶段确定以及体细胞克隆后代与亲本核供体间的DNA微卫星分析技术成为全世界同行公认的哺乳动物体细胞核移植技术的基本程序。

    在短短的几年里,核移植研究从胚胎细胞核移植转入了体细胞核移植研究阶段,世界各地的科学家对各种类型的体细胞核移植进行了有意义的尝试。用胎儿细胞和成年动物体细胞进行核移植的研究进展迅速,所使用的供体细胞也越来越来广泛,并取得了重大进展。迄今为止,已有下面9种供核类型的体细胞核移植后代产生。

    (1)胎儿成纤维细胞:Cibelli 等(1998)采取34日龄牛胎儿成纤维细胞产下了后代。之后Vignon 等(1999)重复了此实验,也获得产仔的结果。后来相继得到了克隆山羊(Baguisi et al., 1999; Keefer et al., 2002),克隆猪(Onishi et al., 2000)和克隆兔(Chesne et al., 2002)。

    (2)成体乳腺细胞:Wilmut等(1997)从妊娠母羊乳腺中采取细胞,重复Campbell等(1996)的实验方法,成功获得了世界首例成年绵羊体细胞核移植后代—Dolly。之后,Zakhartchenko等(1999a)用1 头3岁的牛乳腺上皮细胞核移植得到了克隆牛。

    (3)卵丘/颗粒细胞:Wakayama 等(1998)分离卵母细胞周围的卵丘细胞作为核供体细胞,不经培养直接作核移植,获得50多只克隆小鼠。这是继“多利”后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。之后也相继研究成功克隆牛(Kato et al., 1999; Wells et al., 1999)、克隆山羊(Baguisi & Overstron, 2000)和克隆猪(Polejavea et al., 2000; Cabot et al., 2001)。

    (4)卵管/子宫上皮细胞:Kato 等(1998)进行了输卵管上皮细胞核移植实验,核移植后共获得94枚融合胚,其中24枚发育到囊胚阶段,移植4枚胚胎,最后产下3头牛犊。

    (5)肌肉组织的细胞:法国科学家Bulter等(1998)、Vignon 等(1998)报道了用胎儿肌肉细胞作供体得到了核移植牛。而Shiga 等(1999)采取2岁公牛肌肉细胞,传代培养至少4代,经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。

    (6)成体耳部成纤维细胞: Kubota等(2000)用1头17岁老牛的耳缘皮肤成纤维培养传代至15代,用于核移植,得到了6头核移植牛犊。之后,Park等(2002)采用成体耳部成纤维细胞也获得了克隆猪。

    (7)睾丸支持细胞:Ogura等(2000a)采用未成熟的小鼠睾丸支持细胞进行体细胞核移植而获得了克隆小鼠。

    (8)小鼠尾尖细胞:Wakayama和Yanagimachi(1999)采用成年小鼠的尾尖细胞得到了核移植后代。接着Kato等(1999)和Ogura等(2000b)也分别得到了来自小鼠尾尖细胞的克隆小鼠。

    (9)初乳的乳腺上皮细胞:Kishi等(2000)用从初乳中分离出的乳腺上皮细胞作核移植获得了2只克隆牛。

    综上所述,自体细胞核移植绵羊成功后,体细胞核移植后代已在牛(Kato et al., 1998)、小鼠(Wakayama et al., 1998)、山羊(Bagsuisi et al., 1999)和猪(Polejaeva et al., 2000; Onishi et al., 2000)等动物上获得了成功,下面将对各动物种类的研究进展进行综述。

1.2.1小鼠

    小鼠体细胞核移植研究所采用的方法与其它动物有所不同,在其它动物中所采用的方法是电融合法,小鼠上常用的方法是细胞质内注射法,即通过显微操作将供体细胞直接注入去核卵母细胞内。1989年,Tsunoda等尝试将雄性小鼠的胎儿原始生殖嵴细胞移入去核的合子内,构建的重组胚大多未发育到囊胚。1995年,Kato和Tsunoda的研究证明了胎儿生殖细胞具有发育的全能性或多能性。接着Kimura和Yanagimachi(1995)和Sasagawa等(1998)的研究证明成熟个体的生殖细胞(初级、次级精母细胞)具有发育的全能性,其中Sasagawa等(1998)的移植胚胎经移植后出生了2只小鼠。

    1998年,Wakayama等(1998)采用不经过培养的小鼠卵丘细胞作为核供体,直接注射给去核的卵母细胞,得到了10只可育的小鼠,这也是继“多莉”后第二批哺乳动物体细胞核移植后代,它的成功有力地支持Wilmut等(1997)的试验结果。Wakayama等(1998)同时还进行了公鼠睾丸支持细胞和雌鼠神经细胞的核移植实验并获得了附植的结果,但均中途流产。但是Ogura等(2000a)用来源于未成熟的睾丸支持细胞作供核进行细胞质内注射,获得了后代。用小鼠尾尖细胞作供核,也获得了克隆小鼠(Wakayama & Yanagimachi, 1999; Kato et al., 1999; Ogura et al., 2000b)。其中值得一提的是,这次Ogura等(2000b)采用的是电融合方法获得克隆小鼠的。

1.2.2牛

    在哺乳动物的体细胞核移植研究中,牛的核移植研究是当今的热点,并取得了重大进展。早1995年,Delhaise等就用核移植方法证明来自牛雄性胎儿的原生殖嵴细胞在受体胞质内可以发生发育程序的重编,核移植胚可发育到囊胚。1997年,Lavior等以牛新鲜和冷冻的卵原细胞,早期卵裂球和颗粒细胞为供体构建重组胚,结果重组胚在融合后40h的卵裂率无明显差异,且由这些供体构建的重组胚有部分可以发育到囊胚期,当来自卵原细胞的桑椹胚和囊胚移植到受体后,重组胚可以发育为胎儿和胚外组织。这些都为体细胞克隆牛奠定了基础。Kato等(1998)和Cibelli等(1998)分别用成年牛的卵丘细胞、输卵管上皮细胞和转染的胎儿成纤维细胞作为供体得到了体细胞核移植牛犊。几乎同时,法国科学家也报道了用胎儿肌肉细胞经过培养传代后作供体得到了核移植牛(Bulter et al., 1998; Vignon et al., 1998)。而Shiga 等(1999)采取2岁公牛肌肉细胞,传代培养至少4代,经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。Hill等(2000a)用血清饥饿法处理牛胎儿成纤维细胞后在进行核移植,可显著提高重组胚的囊胚形成率,而血清饥饿法处理对成体成纤维细胞的核移植胚胎的发育没有影响。Wells等(1999)从活体牛卵巢内采集得到颗粒细胞作为核供体,获得了10头核移植牛,成功率达到10%。杨向中实验室于2000年3月公布了用17岁龄公牛的耳部成纤维细胞,成功得生下了6头克隆牛(Kubota et al., 2000)。Oikawa等(2000)从一头20岁的日本黑牛获得了颗粒细胞,经传代培养(5代)和血清饥饿培养后,核移植后获得了2头牛犊。由此可见,核移植技术可为濒危动物拯救开辟了一条新的途径。

1.2.3猪

    相对于其它动物而言,猪的体细胞克隆研究困难较大,进展很慢。在1995年,Liu等就将猪原始生殖细胞(Primordial Germ Cells, PGCs)移植到兔卵母细胞质内,核移植胚胎卵裂并发育到4-细胞期。Tao等(1999)和Prather等(1999a)在完善猪卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养技术后,用体外培养的卵母细胞和胎儿成纤维细胞获得了发育到囊胚期的核移植胚胎12枚,从这些结果也可以发现猪胎儿成纤维细胞在去核的卵母细胞内同样可以发生发育程序的重编,预示着猪体细胞核移植即将获得成功。接着Ott 等(2000)、Uhm 等(2000a)、Verma 等(2000)和Koo 等(2001)等利用胎儿成纤维细胞和卵丘细胞与体外培养卵母细胞构建重组胚都发育到了囊胚阶段。Kim 等(2000)的研究发现,用胎儿成纤维细胞进行核移植所构建的重组胚的转录和DNA合成发生在24h。2000年3月,PPL公司宣布通过体细胞核移植技术获得5头世界上的第一批体细胞克隆猪(Dave, 2000)。2000年8月,Onishi等将胎儿成纤维细胞直接注入体内成熟去核的卵母细胞内,得到了1头雌性仔猪。同年,Polejaeva等(2000)改进核移植方法,先将颗粒细胞与去核卵母细胞融合,当核移植胚胎发育到原核期后再进行核移植,将核移植胚的原核与体内受精的原核期受精卵的原核进行交换,胚胎移植后由185枚胚胎获得了5头白色的仔猪,核移植效率达到1.2%(Polejaeva et al., 2000)。Betthauser等(2000)也报道了体细胞核移植的4头健康的雄性仔猪。随着猪体细胞核移植技术的发展,人们在研究如何提高核移植胚胎体外发育率(Betthauser et al., 2001; Klocke et al., 2001; Kuhholzer et al., 2001a, b)和利用皮肤成纤维细胞进行核移植的同时(Roh et al., 2001),逐步将研究重点转向转基因克隆猪的研究(Park et al., 2001; Uhm et al., 2000b; Koo et al., 2001)。2001年 4月,PPL公司宣布他们在去年得到体细胞核移植猪后,又通过体细胞核移植的方法得到了5头带有人类基因的转基因猪,这些猪可望减小与人体器官的免疫排斥反应,为人类提供可移植的器官(网上新闻报道,见PPL公司主页www.ppl-therapeutics.com)。正因为转基因猪具有如此巨大的商业价值,利用体细胞核移植技术生产转基因猪是未来猪体细胞核移植的主要方向。

1.2.4兔

    兔的体细胞核移植的研究进展相对较慢。Moens等(1996)将妊娠18-20天的兔胎儿生殖细胞与去核卵母细胞融合,来自雄性和雌性性腺细胞的重组胚卵裂率相同(均为37%),而用培养4天后雄性性腺细胞构建的重组胚囊胚发育率(16%)明显高于雌性的(4%),表明了雄性和雌性二倍体生殖细胞在去核卵母细胞的发育程序重编潜力不同。Yin等(2000)将卵丘细胞经传代培养3-5代后,与去核卵母细胞融合,用电脉冲和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)结合激活重组胚,其卵裂率和囊胚率发育率分别为66%和23%,174枚重组胚移植到8只受体后,在其中3只受体上观察到3个植入位点,但未发现胎儿。Dinnyes等(2001a)以兔耳部成纤维细胞为供体构建重组胚,得到与Yin等(2000)相近的卵裂率和囊胚发育率。我国的李光鹏(2000)用肌纤维细胞为供体,重组胚囊胚发育率为37.1%。Chensne等(2001)发现卵丘细胞构建的重组胚的囊胚发育率(46.7%)明显高于胎儿成纤维细胞(3.6%),但后者则获得了产兔的结果(Chesne et. al., 2002)。

1.2.5羊

    Ledda等(1996a)将羊PGCs植到去核的卵母细胞内,重组胚在体外可以发育,但移植后未出生后代。1997年,Wilmut等用成年绵羊乳腺上皮细胞克隆出了世界上第一头首例体细胞核移植羊,这也是人们在长期进行体细胞核移植研究所获得的突破性成果。Wells等(1997)采用与Wilmut等(1997)相似的方法,从一枚8天的羊雄性囊胚的ICM获得了细胞,体外培养后建立细胞系,用低浓度血清诱导G0期,分别移植到去核体内、外成熟的卵母细胞内,最后获得了3只雄性羔羊。克隆羊克隆牛的技术程序相似,但克隆绵羊大多采用体内成熟的卵母细胞作受体胞质。克隆羊的效率也和所报道的克隆牛的效率相似(Colman, 2000)。转基因克隆羊的研究也取得了重大突破,已相继研究成功转基因克隆绵羊(Schnieke et al., 1997; McCreath et al., 2000)和克隆山羊(Keefer et al., 2001)。

    我国克隆羊的研究进展很快,郭继彤等(2000)用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作为核移供体,将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内,获得了两只遗传上相同的体细胞核移植山羊,这也是世界上首批成年体细胞克隆山羊。在转基因克隆羊的研究上,也取得了一定的成绩。安晓荣等(2001)报道用体细胞克隆出了绵羊转基因囊胚。成勇等(2002)以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。

1.3胚胎干细胞核移植研究进展

    胚胎干(Embryonic Stem, ES)细胞是早期胚胎细胞或囊胚ICM细胞经抑制分化后培养而筛选出来的一类全能性细胞,这种细胞具有正常的二倍体核型,它既可以在特定条件下进行无限增殖而不发生分化,又可以在特定条件下分化为包括生殖系在内的各种细胞和组织(Evans & Kaufman, 1981)。此外,将从胎儿的原生殖嵴分离出来的PGCs进行培养,也可以形成在功能和形态上与ES细胞相似的细胞系。ES细胞具有体外发育的全能性,并且可以在体外无限传代,因此,它是动物克隆的理想供体细胞。ES细胞作为核移植供体细胞与体细胞的制备方法类似,亦需进行细胞周期的调控。

    迄今为止,只有在小鼠和人已培养建立ES系,而牛、兔、羊、猪仅获得了拟干细胞,因此用真正的ES细胞进行核移植只有小鼠是获得了成功(Wakayama et al., 1999b)。

    在研究早期,Tsunda和Kato等(1993)将小鼠的ES细胞移入去核卵母细胞内,核移植胚胎体外发育到桑椹胚和囊胚期,移植到受体后也发现有植入位点,但未获得核移植后代。Sims和First(1994)将培养的ICM注入到去核卵母细胞,获得4头牛犊。Campbell等(1995)将山羊第三代的ES样细胞进行核移植,获得了活的核移植羔羊。猪的ES样细胞,在核移植后可以指导胚胎发育到囊胚阶段,目前仍没有活的后代出生(Chen et al., 1999)。虽然牛ES样细胞经过核移植后,出生的后代在生后不久死亡,但也证明了牛ES样细胞可以参与胎儿的发育,具有发育的全能性(Iwasaki et al., 2000)。Wakayama等(1999b)在继小鼠的体细胞核移植成功后,又利用相同的技术对小鼠ES细胞进行核移植,得到了核移植小鼠31只。该研究证明了用ES细胞进行核移植产生后代的可能性。由于ES细胞在体外具有无限增殖而不发生分化的特性,故可以在体外更方便地对ES细胞进行基因改造,通过基因“敲除”和“插入”来研究基因的功能,Sato等(2000)用小鼠的ES细胞系TT2的细胞直接注射入去核的卵母细胞内,核移植胚胎可发育到妊娠14天,但未能出生小鼠。已报道利用小鼠ES细胞可以定向分化为造血细胞(Perkins, 1998),而利用人ES细胞可以在体外分化如分化为分泌胰岛素的胰岛素样细胞(Odorico et al., 2001)等多种细胞。最近,Wakayama等(2001)报道将个体细胞核移植后得到了sntES细胞(具有ES细胞的特性)移植到去核卵母细胞胞质内,获得了20只小鼠,其中11只小鼠发育正常并具繁殖能力。由此表明,sntES细胞器具有发育全能性,可以建立成年动物自身的干细胞系,这些干细胞可以分化产生各种细胞、组织和器官,用于进行自身疾病的细胞治疗。因此对人类体细胞核移植和干细胞的研究与应用有深远的影响。目前,利用ES细胞进行核移植的主要研究方向是利用这些细胞生产转基因动物,并利用核移植建立成年动物体细胞核移植ES细胞系。

1.4转基因克隆动物研究进展

    随着哺乳动体细胞核移植技术的发展,以及人和家畜基因组计划的完成,转基因技术的研究走出了20世纪90年代徘徊不前的局面,进入了新的发展时期,即转基因克隆动物时期。转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆技术的有机结合,它是以动物体细胞为受体,将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞,再以这些体细胞为核供体,进行动物克隆。

    PPL公司Schnieka等(1997)率先克隆出了转基因动物。他们是从35日龄胎儿分离的体细胞,经传代培养后和基因转移后,将转染了新霉素抗性(Neomycin)基因和人凝血因子(IX)基因的体细胞移植到受体卵母细胞内,出生了带有IX基因的转基因羊。Cibelli等(1998)用一个55日龄的雄性牛胎儿分离得到成纤维细胞,体外培养后转代两次,用标记ß-gal/neo对细胞进行转染,转染的细胞用新霉素筛选两周之后,得到5个抗性细胞克隆,经PCR分析,发现它们都是转基因细胞,而且表明了标记基因,选择其中一个细胞为核移植供体,通过核移植得到重组胚276个,其中33个(1%)发育到囊胚,经移植到11头同期化的受体母牛体内后,出生了4头小牛,经过分析检测,发现这4头小牛都在同一个染色体位点整合了外源基因,说明了它们来源于同一个体细胞克隆,而实验中的转基因效率达到了1.4%。1999年,Baguisi等克隆出来的5只转基因山羊中,其中的1只羊在奶中表达了高水平的抗凝血因子III。2000年,McCreath等用基因打靶后的绵羊体细胞生产了转基因绵羊。随后转基因山羊(Keefer et al., 2001)和转基因猪(Lai et al., 2002)也相继获得成功。

    我国的转基因克隆技术也取得了一定的成绩。安晓荣等(2001)报道用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,用绵羊的转基因颗粒细胞进行核移植,得到了发育的绵羊转基因囊胚。成勇等(2002)以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。

1.5种间细胞核移植研究进展

    细胞核移植作为一种重要的科学研究方法,随着这项技术的不断成熟,它也成为挽救濒危动物的一个重要手段,由于濒危动物的卵母细胞来源较少,进行体细胞核移植的难度增大,人们就希望通过种间核移植技术来达到这个目的。但在这方面的研究进展是较为缓慢。

    De Roeper 等(1977)将Hela移入非洲爪蟾卵内,结果发现Hela细胞在爪蟾内能够发生染色体扩散和DNA合成,表明爪蟾卵母细胞内有能够激活哺乳动物体细胞的因子,这种激活因子无特异性。McGrath和Solter(1986)利用他们在小鼠胚胎细胞核移植上的方法进行小鼠不同种间原核交换研究,结果获得的种间核移植胚仅出现有限次数的卵裂。梅琪等(1993)进行的鼠-兔种间核移植研究,结果重组胚胎有43.1%分裂率,5.4%发育到囊胚。谭世俭等(2001)作的水牛-黄牛种间胚胎细胞核移植研究,获得了发育的种间核移植囊胚。李光鹏(1998)将小鼠8-细胞胚的卵裂球移入猪去核卵后,重组胚可卵裂至8细胞期。Dominko等(1999)等以牛、猪、羊、大鼠和猴的皮肤成纤维细胞为核供体,牛卵母细胞为核受体,探索牛卵母细胞在已分化体细胞核指导下的有丝分裂能力及用牛卵母细胞作为受体胞质的可能性。结果表明,除了大鼠-牛杂种胚外,其余都发育到囊胚阶段,但是杂种胚移植到受体后没有出生后代。然而,就种间核移植胚发育到囊胚而言,牛卵母细胞维持发育的能力没有因供核动物的物种,染色体数目和年龄的不同而表现出差异,表明哺乳动物保留着调节早期胚胎发育的机制,牛卵母细胞的胞质能支持具有不同染色体种类和数目的异种核发育。Lanza等(1999a, b)把人的体细胞核移植到牛的去核卵母细胞,得到的一些类似核移植胚胎也都发育到较高级阶段。近年来,人们尝试了黄牛-水牛(Kitiyanant et al., 2000; Nguyen et al., 2000),小鼠-猪(Lee et al., 2001),小鼠-牛(Arat et al., 2001; Liu et al., 2001),以及猪-牛(Yoon et al., 2001)等动物种间体细胞核移植的研究,都分别得到了体外发育的胚胎。目前,Lanza等(2000b)的研究获得了令人振奋的结果。他们把一种野牛的皮肤成纤维细胞核移植到家牛的去核卵母细胞中,发育到了妊娠晚期并已分化成复杂的组织和器官的野牛胎儿。接着,Vogel(2001)报道将印度野牛的体细胞作供核移植到去核的家牛卵母细胞内,最后出生了1头发育正常的野牛,但出生后2天就死了,但这一结果无疑证明哺乳动物体细胞可以在异种卵母细胞内完成核发育程序重编,使已分化的体细胞发生去分化并完成整个发育过程。也预示着我国在体细胞克隆大熊猫、猕猴及比格犬上有可能成功。虽然我国科学家陈大元等(1999)把大熊猫的体细胞核移到兔卵母细胞中,重组胚能发育到囊胚阶段,但目前未能获得的后代。这一事实说明,种间核移植确有一定的难度,只有在诸如核发育程序重排程度和可靠性、供体细胞胞质和受体胞质(例如线粒体DNA)之间的相容性等问题弄清后,才有可能实现种间核移植。

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